不同濃度的糖對原代心肌細胞存活率的影響

白 雪，楊曉敏

1.內蒙古科技大學包頭醫學院研究生院，內蒙古 包頭 014040；2.包頭醫學院第二附屬醫院，內蒙古 包頭 014030

原代心肌細胞的培養目前已成為心血管疾病基礎研究的必要條件之一，根據研究目的在體外模擬疾病狀態下心臟所處的環境，可建立各種心肌細胞的病理模型，以便更好地從細胞和分子水平等研究心血管疾病的發病機制。早在 1960 年，科學家 Harary 和 Farley［1］培養出了 Wister乳鼠心肌細胞，并提出了乳鼠原代心肌細胞的培養方法，然而這一傳統方法所分離的心肌細胞存活率以及純度低、細胞活性比較差等原因，不能滿足基礎實驗研究的需求。1976年，科學家提出了成熟心室肌的培養方法，并在1977年由Jacobson成功培養出了心室肌細胞。到目前為止，原代心肌細胞的體外培養技術日漸成熟，所用的心肌細胞培養大多是在傳統方法基礎上進行改良，分別為單一酶消化法［2-3］和膠原酶與胰酶聯合使用消化法［4-6］兩種。但兩種方法各有不足之處，為了培養出純度高、存活率強能夠滿足實驗需求的心肌細胞，結合本實驗室的條件以及環境在傳統的方法上進行了改進，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

取新生1～3 d的wistar大鼠，清潔級，雌雄不限，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號scxk（京）2014-0004。

1.2 實驗試劑及主要儀器

Ⅱ型膠原酶（Gibco，1797342），低糖型DMEM（Gibco），胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS，四季青），青鏈霉素雙抗（HyClone），D-（+）-Glucose（Sigma），磷酸鹽緩沖液（PBS），5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Brdu，Sigma），4%多聚甲醛（博士德生物），α-actin 抗體兔來源（博士德生物），二氨基聯苯胺（3，3'-diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒，SABC（鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物法）免疫組化試劑盒，二甲苯，TritonX-100（生工生物工程有限公司），37℃恒溫水浴鍋，磁力攪拌器，酶標儀（BIO-RAD），CO2培養箱（Thremo），醫用超凈工作臺，熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS-IX71），多功能臺式高速離心機（Eppendorf，5804R0）等。

1.3 原代心肌細胞的培養

（1）準備3 個直徑為60 mm 的培養皿加入10 ml 含雙抗無血清的 DMEM 擠血用。（2） 取出生 1～3 d 的 wistar 乳鼠6只，頸部脫臼處死后，用75%酒精消毒兩次，左手捏住頸部皮膚，右手持眼科剪沿胸骨中線剪開，左手輕輕擠壓，右手持眼科鑷輕輕將心臟取出即刻放入培養皿中，依次在第一、第二個培養基中輕輕擠壓心臟排出積血，之后鈍性分離心室心尖部位置，剪去心蒂部1/3～1/2，暫存于第三個平皿中。（3）將所有的心臟放入高壓滅菌后的小燒杯中，加入1 ml 膠原酶。用眼科剪將所有心臟剪成0.5～1 mm3的大小的小塊，再次加入2 ml 的膠原酶消化液，輕輕晃動小燒杯5～8次后棄去消化液。（4）再次加入3 ml膠原酶消化液，并用玻璃彎頭吸管將心臟組織與消化液一同準入100 ml 的血清培養瓶中，放置于37℃恒溫水浴鍋中，消化8～10 min，期間輕輕晃動血清瓶，隨后棄去消化液。（5）在培養瓶中再次加入3 ml 膠原酶消化液，繼續消化10 min，期間每隔2 min輕輕晃動培養瓶60 s，將消化好的液體吸出加入事先準備好的兩只50 ml 離心管中，離心管中提前加入18 ml 已溫育好的含10%FBS 的低糖DMEM，均勻終止消化，重復以上步驟10次，直至組織被消化為白色絮狀物為止。（6）收集10 次消化好的細胞800 r/min 離心5 min，棄掉上清后，每支離心管加入溫育好的10%FBS的DMEM 6ml，重懸細胞混勻后經300 目濾網過濾，濾液加入到一次性培養瓶中，放于37℃培養箱中差速貼壁90 min。（7）取出培養瓶，輕輕晃動，用彎頭吸管輕輕吸取上層懸液于15 ml離心管中混勻后，鋪于帶有爬片的24孔板中，每孔1 ml細胞液并加入終濃度為0.1 mmol/L的Brdu溶液10 ul，抑制成纖維細胞生長。24 h 后換10%FBS 的DMEM液體。

1.4 原代心肌細胞免疫組化鑒定

免疫組化采用橫紋肌肌動蛋白（α-actin），兔來源抗體。細胞培養48 h后，將爬片取出，1×PBS洗去殘留的血清及培養基。用預冷的4%多聚甲醛固定20 min。1×PBS漂洗，0.1%的Triton x-100 通透15 min，后經內源性過氧化物酶滅活，5%BSA液封閉，一抗以1∶100孵育，濕盒4℃過夜后加羊來源的二抗孵育，最后DAB 顯色，蘇木素復染，封片后顯微鏡拍照。

1.5 實驗分組

正常細胞在含 10%FBS 的 DMEM 中培養 48～72 h 后，細胞換液為含1%FBS 的DMEM 饑餓24 h，然后設置不同糖濃度組，實驗分為6組，分別為對照組基礎培養基（含糖5.5 mmol/L），高糖組20 mmol/L，33 mmol/L，40 mmol/L，50 mmol/L，60 mmol/L。

1.6 倒置顯微鏡觀察心肌細胞搏動頻率與節律

記錄高糖作用20 h、48 h、72 h后的心肌細胞在1 min內的搏動次數，同一糖濃度的不同視野中選取5個細胞計數搏動頻率。

1.7 MTT檢測不同組的細胞存活率

將消化好的原代心肌細胞進行計數，計數范圍在105～106，細胞稀釋后每孔加200 ul，最終保證每孔的有效細胞數為102～104之間。空白調零孔只加不含細胞的基礎培養基。實驗分組處理后（每組設置三個復孔），每個孔中加入5 g/L的MTT溶液20 ul，繼續培養4 h后，小心吸去孔中所有液體，吸干凈后，加入150 ulDMSO，室溫搖床搖10 min，使結晶充分溶解，酶標儀測490 nm 處吸光度（OD）值。計算細胞存活率，細胞存活率=（實驗組OD值-空白組OD值/對照組OD值-空白組OD值）×100%。

1.8 統計學方法

采用SPSS 19.0 軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差One way-ANOVA分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 顯微鏡下細胞形態

消化好的心肌細胞鏡下為亮圓形；培養12 h后開始貼壁，部分細胞伸出偽足，形態以圓形和三角形多見；18 h小時后開始出現搏動，24 h后已基本貼壁；培養48 h后細胞搏動明顯，平均搏動（85±7）次/min，呈典型的梭型狀，也有細胞呈團簇狀生長，立體感十分明顯，收縮強勁有力，成纖維細胞無立體感。培養5 d 后，細胞成團狀搏動頻率一致，見圖1。

圖1 原代心肌細胞培養48 h后形態圖

2.2 心肌細胞免疫組化鑒定

免疫組化鑒定心肌細胞a-actin 表達陽性細胞呈現棕色，如圖2a，圖2b 陽性率在95%以上，而成纖維細胞則不表達，如圖2c中箭頭所指，見圖2。

圖2 心肌細胞與成纖維細胞免疫組化鑒定

2.3 糖對心肌細胞搏動次數的影響

高糖作用20 h 時，糖濃度為40 mmol/L、50 mmol/L、60 mmol/L 的心肌每分鐘搏動次數明顯加快，為（153±7）次/min，（138 ± 7）次/min，（113 ± 5）次/min 與 對 照 組5.5 mmol/L（36±5）次/min 的糖濃度相比差異有統計學意義（P＜0.05）；高糖作用48 h 時，糖濃度為40 mmol/L、50 mmol/L、60 mmol/L 組心肌搏動次數顯著下降，分別為（40±4）次/min，（50±3）次/min，（40±4）次/min與對照組（109±3）次/min 相比差異有統計學意義（P＜0.01），高糖作用48 h糖濃度為20 mmol/L和33 mmol/L兩組、40 mmol/L 和60 mmol/L 兩組之間細胞搏動次數差異無統計學意義（P＞0.05）；高糖作用72 h 后，與對照組5.5 mmol/L 糖濃度相比，實驗組心肌搏動次數明顯低于對照組（P＜0.05），且搏動頻率不一致、不規律，表現為異常自律性，見圖3。

2.4 各組細胞MTT結果

分組后培養48 h，與對照組相比，高糖組20 mmol/L、33 mmol/L、40 mmol/L、50 mmol/L、60 mmol/LOD 值逐漸下降（P＜0.01），細胞存活率明顯降低（P＜0.05），以50 mmol/L和60 mmol/L下降最明顯，分別為（50.5%±4.7）和（48.7%±9.8），見圖4。

3 討論

圖3 不同濃度糖作用20 h、48 h、72 h后心肌細胞每分鐘搏動次數

圖4 高糖作用48 h后心肌細胞存活率

原代心肌細胞培養作為心血管疾病發生的分子機制研究發揮著不可替代的作用，在排除神經、體液等因素的影響，保持完整的心肌的結構與功能觀察藥物或者毒物對心肌的作用影響等，是一項重要的體外基礎試驗。高效率的培養方法是實驗開展的基礎條件。對于乳鼠的選擇，我們認為成年的大鼠心臟不具備分裂增殖能力，屬于終末分化細胞［7］，大鼠出生年齡越短其心肌細胞分離后的存活能力越強，越容易貼壁生長，因此選擇大鼠新生1～2 d 的乳鼠分離心臟培養心肌細胞。同時要選擇具有正常生育周期、哺乳周期的大鼠，這樣才可以繁殖出狀態最好的乳鼠。對于實驗膠原酶的選擇，我們選用Ⅱ型膠原酶，配制成0.06%的濃度消化，其作用溫和短時多次消化可以消化完全，增加細胞產量，同時做到對細胞最小的損傷。實驗成功的關鍵點之一即做到無菌操作，所有用到的器械、培養瓶、燒杯都要經過高壓滅菌，紫外照射除菌。

本實驗探討了不同糖濃度的培養基對原代心肌細胞增殖的影響，在基礎培養基培養48～72 h 之后，細胞跳動次數達80次/min，換成低營養的培養基饑餓培養24 h后，分為不同糖濃度組，繼續培養的20 h、48 h、72 h后，細胞的跳動具有明顯差異，尤以40 mmol/L、50 mmol/L、60 mmol/L表現最明顯，這三組在分組后的20 h之內搏動頻率快速增加，到20 h達到峰值，之后一直到72 h搏動頻率快速下降，且在48 h之后心肌搏動不規律，表現為異常的自律性。而對照組即用基礎培養基培養的細胞隨著時間延長，搏動次數逐漸增加最后趨于穩定，心肌搏動頻率一致，活力較高糖組好。MTT 檢測細胞存活率，高糖作用48 h 后，設對照組細胞存活率為100%，高糖組心肌細胞存活率與對照組相比明顯下降，表明高糖抑制細胞的增殖。高糖環境對細胞的損傷是多方面的，但其具體的機制目前尚不清楚［8］，可能的原因有高糖的糖毒性增加了心肌細胞的氧化應激、細胞的凋亡等［9-11］，有研究顯示［12］，高糖條件下，c-Src/PI3K/ERK通路表達失調是高糖對細胞造成損傷的一個原因。高糖導致的內質網應激、晚期糖基化終末產物增加都會導致心肌細胞的損傷，高糖抑制細胞的增殖導致心肌細胞搏動節律性改變的具體分子機制，有待課題組進一步探討探究。