一測多評法測定6種大豆異黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

李 秀， 馬家輝， 顧 陽， 楊 燕， 成向榮

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122）

大豆異黃酮是豆類生長過程中形成的一類次生代謝產(chǎn)物，在大豆及其制品中含量豐富。作為豆類及其制品中重要的生物活性物質(zhì)，其抗氧化等生理活性[1-6]，受到營養(yǎng)學(xué)家廣泛關(guān)注。人們從大豆中成功分離出的大豆異黃酮已經(jīng)達(dá)到12種，包括3種游離型異黃酮苷元、3種異黃酮葡萄糖苷、3種異黃酮乙?；咸烟擒蘸?種異黃酮丙二?；咸烟擒誟7-8]。其中，異黃酮乙酰基葡萄糖苷、丙二?；咸烟擒赵诙怪破芳庸み^程中較不穩(wěn)定，且對照品極難制備與獲取。目前美國分析化學(xué)家協(xié)會AOAC主要通過對大豆及其制品進(jìn)行提取、皂化后進(jìn)行HPLC測定大豆異黃酮苷元及葡萄糖苷的含量[9]。目前，國內(nèi)對6種大豆異黃酮的測定主要參照《保健食品中大豆異黃酮的測定方法 高效液相色譜法》（GB/T23788-2009）[10]和《糧油檢測 大豆異黃酮含量測定 高效液相色譜法》（GB/T26625-2011）[11]。這兩種國標(biāo)方法均是對大豆苷、大豆苷元、黃豆苷元、黃豆黃素、染料木苷、染料木素等6種大豆異黃酮進(jìn)行高效液相色譜測定，需要購置多個對照品配置標(biāo)準(zhǔn)溶液，檢測效率相對較低且增加檢測成本[12]。

“一測多評”法 （quantitative analysis of multicomponents by single-marker， QAMS）是近年來主要應(yīng)用于中藥領(lǐng)域的多成分質(zhì)量控制的研究方法，它運(yùn)用成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系，采用單個易獲得的對照品對多個成分進(jìn)行定量，實(shí)現(xiàn)多個成分（對照品沒有或難以供應(yīng)）的同步測定，目前已用于解決中藥質(zhì)量控制中缺乏對照品這一瓶頸問題[13-15]。作者以豆制品中含量豐富、對照品易得的大豆苷為參照，通過分析大豆苷、大豆苷元、黃豆苷元、黃豆黃素、染料木苷、染料木素等6種大豆異黃酮在高效液相色譜行為學(xué)上的差異，基于它們的結(jié)構(gòu)共性，尋找在色譜行為學(xué)及光譜學(xué)上的內(nèi)在聯(lián)系，以此建立大豆異黃酮的一測多評分析方法，并運(yùn)用于常見的大豆及其制品中大豆異黃酮的含量測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆苷、大豆苷元、黃豆苷元、黃豆黃素、染料木苷、染料木素：江蘇永健公司產(chǎn)品；甲醇（色譜純）、甲酸（分析純）：國藥集團(tuán)產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀：島津公司產(chǎn)品；1525高效液相色譜儀：沃特世公司產(chǎn)品；1100高效液相色譜儀；Inertsil ODS-SP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Ultimate AQ C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）、Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）：安捷倫公司產(chǎn)品；UV2300雙光束紫外可見分光光度計：上海天美科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理 稱取腐竹、豆腐干、千張、大豆和豆腐樣品10～50 g，粉碎，55℃真空干燥 24 h，進(jìn)一步粉碎后過100目篩，精密稱取0.2 g，置于試管中，加入5 mL甲醇，密塞，超聲提取30 min，用甲醇補(bǔ)足原質(zhì)量，離心過濾，濾液備用。

1.3.2 對照品處理 精確稱取大豆苷14.4 mg，大豆苷元3.0 mg，黃豆黃苷3.0 mg，黃豆黃素1.2 mg，染料木苷1.2 mg，染料木素6 mg，置于100 mL燒杯中，混合，先加少量甲醇溶解后，移入200 mL容量瓶中并用甲醇稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度分別為72、15、15、6、6、30 μg/mL 的混合對照品溶液，并等比例稀釋2.5倍5次，得到6個不同質(zhì)量濃度梯度的溶液，以制作混合對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定線性范圍。

另精確稱取大豆苷14.4 mg，大豆苷元3.0 mg，黃豆黃苷3.0 mg，黃豆黃素1.2 mg，染料木苷1.2mg，染料木素6 mg，先加少量甲醇溶解后，分別移入200 mL容量瓶中并用甲醇稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度分別為 72、15、15、6、6、30 μg/mL 的單一對照品溶液，與混合對照品一樣分別按等比例稀釋2.5倍5次，得到6個不同質(zhì)量濃度梯度的6組單一對照品溶液，以制作6種大豆異黃酮單一對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 色譜條件 采用島津LC-20A高效液相色譜儀進(jìn)行大豆異黃酮的檢測，色譜柱：InertsilODS-SPC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫 30℃；進(jìn)樣量 10 μL；雙檢測波長262 nm和248 nm；流量1.0 mL/min；流動相：A為體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸水溶液，B為甲醇，并設(shè)計了3組洗脫程序：

0～60 min，B： 體積分?jǐn)?shù) 55%等度洗脫；0～20 min，B：35%～55%梯度；20～35 min，B：55%等度洗脫；0～30 min，B：30%～90%梯度洗脫。

1.3.4 建立一測多評分析方法

1）線性關(guān)系考察 分別精密吸取6個質(zhì)量濃度梯度的混合對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中，按1.3.3色譜條件測定。以對照品溶液的峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算6種大豆異黃酮的回歸方程，確定線性范圍。

2）相對校正因子、相對保留時間、相對峰面積的計算 分別精密吸取6個不同質(zhì)量濃度的單一對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中，按1.3.3色譜條件測定。對262 nm下的測定結(jié)果進(jìn)行分析，按公式1計算以大豆苷為內(nèi)參物，對黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的相對校正因子fk/m；按公式2計算以大豆苷為內(nèi)參物的相對保留時間Tm/k。計算262 nm和248 nm下的峰面積比值，即為相對峰面積，記為A262/248[16]。

式（1）、（2）中：Wk為內(nèi)參物k的質(zhì)量濃度；Ak為內(nèi)參物k的峰面積；Wm為待測成分m的質(zhì)量濃度；Am為待測成分m的峰面積；Tk，Tm分別為待測成分和內(nèi)參物的保留時間。

3）精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀中，連續(xù)進(jìn)樣6次，按1.3.3色譜條件測定，記錄262 nm下的色譜圖，測定峰面積。計算6種大豆異黃酮各成分峰面積的RSD值。

4）穩(wěn)定性試驗 取同一混合對照品溶液，分別在 0，2，4，8，12，24 h 時， 精密吸取 10 μL 注入高效液相色譜儀中，按1.3.3色譜條件測定，記錄262 nm下的色譜峰，測定峰面積。計算6種大豆異黃酮各成分峰面積的RSD值。

5）重復(fù)性試驗 精密稱取腐竹樣品粉末0.2 g，共6份，按1.3.1樣品溶液的處理方法制備后，精密吸取10 μL按1.3.3色譜條件進(jìn)樣，記錄262 nm下的色譜圖，測定峰面積。采用一測多評分析方法，大豆苷的含量按外標(biāo)法進(jìn)行測定，再結(jié)合相對校正因子，按如下公式3計算樣品中另外5種大豆異黃酮的含量[17]。

式（3）中：Wk為內(nèi)參物k的質(zhì)量濃度；Ak為內(nèi)參物k的峰面積；Wm為待測成分m的質(zhì)量濃度；Am為待測成分m的峰面積。

6）加樣回收率試驗 精密稱取適量已測定含量的樣品粉末6份，分別加入一定量的大豆苷、黃

1.3.5 耐用性試驗 在1.3.3色譜條件下，改用安捷倫和沃特世的高效液相色譜儀以及UltimateAQC18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，進(jìn)行測定，記錄 262 nm 下的色譜圖，測定峰面積，計算以大豆苷為內(nèi)參物，對于黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的相對校正因子，考察3個不同品牌的高效液相色譜儀以及3根不同品牌的色譜柱對其相對校正因子的影響。

在1.3.3色譜條件下，改變流量（0.9，1.0，1.1，1.2 mL/min）和柱溫（25， 30， 35 ℃），進(jìn)行測定，記錄262 nm下的色譜圖，測定峰面積，計算以大豆苷為內(nèi)參物，對于黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的相對校正因子，考察流速和溫度對其相對校正因子的影響。

1.3.6 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 按照1.3.5的步驟，記錄262 nm和248 nm下的色譜圖，測定峰面積。并記錄262 nm下6種大豆異黃酮的保留時間，然后以大豆苷為內(nèi)參物，計算對黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的相對保留時間。

1.3.7 驗證比對 精密吸取樣品溶液、混合對照品溶液以及單一大豆苷對照品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀，按1.3.3色譜條件測定，記錄色譜圖，測定峰面積。分別采用外標(biāo)法和一測多評法計算待測樣品中的6種大豆異黃酮含量。并將常規(guī)的外標(biāo)法實(shí)測含量與一測多評計算的含量采用夾角余弦值進(jìn)行比較，公式如式（5），驗證建立的一測多評分析方法的準(zhǔn)確性[19]。豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素對照品溶液，按1.3.2樣品溶液的處理方法制備加標(biāo)樣品后，分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀中，按1.3.3色譜條件測定，記錄262 nm下的色譜圖，測定峰面積。按如下公式計算加樣回收率[18]。

對建立的一測多評分析方法進(jìn)行應(yīng)用與驗證時，按如下公式6計算兩種方法的相對誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 一測多評方法的建立

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化 6種大豆異黃酮的甲醇溶液在200～400 nm進(jìn)行紫外波長下掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異黃酮分別在208、248、262 nm處出現(xiàn)明顯吸收峰（圖1）。為了減少溶劑的干擾的影響，選用262 nm作為HPLC檢測波長。同時為了較好地識別待測色譜峰，選用248 nm作為輔助的檢測波長。

圖1 6種大豆異黃酮的紫外光譜圖Fig.1 Ultraviolet spectra of six soybean isoflavones

周光明等人[20]在測定綠豆芽4種大豆異黃酮含量時，液相色譜條件采用的流動相為A：體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸水溶液，B：乙腈；洗脫程序為：0～10 min，B：5%～80%；10～16 min，B：80%；16～22 min，B：80%～5%。于寒松等人[8]在測定12種大豆異黃酮時，液相色譜條件采用的流動相為A：體積分?jǐn)?shù)0.1%乙酸水溶液，B：體積分?jǐn)?shù)0.1%乙酸的乙腈溶液。洗脫程序為：0～80 min，B：體積分?jǐn)?shù)13%～40%。作者參考了上述的色譜條件，并設(shè)計了3組洗脫程序（見實(shí)驗方法1.3.3）?？紤]到大豆及其制品中存在較多的水溶性成分，可能對待測目標(biāo)成分形成干擾，因此控制待測目標(biāo)成分在10 min后出峰。其中洗脫程序（2）可以較好的分離所測的6個大豆異黃酮，且分析所需的總時間較短，可在35 min內(nèi)同時檢測6個目標(biāo)大豆異黃酮，優(yōu)于另外兩個洗脫程序。

經(jīng)優(yōu)化后，確定高效液相色譜分析條件如下：色譜儀：島津LC-20A高效液相色譜儀；色譜柱：Inertsil ODS-SP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A為體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸水溶液，B為甲醇；洗脫程序如下；流量為 1.0 mL/min；進(jìn)樣量 10 μL；柱溫為30℃；檢測波長：262 nm和248 nm。

2.1.2 線性關(guān)系 對6個梯度質(zhì)量濃度的混合對照品溶液進(jìn)行HPLC分析，色譜圖如圖2所示。以對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到6種大豆異黃酮對照品的回歸方程，見下表1。分析結(jié)果表明，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素在各自的線性范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（R2＞0.999 9）。

2.1.3 相對校正因子 按實(shí)驗方法1.3.3進(jìn)行大豆異黃酮對照品的混標(biāo)分析，根據(jù)公式1計算以大豆苷為內(nèi)參物，對黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的相對校正因子[21]，結(jié)果如下表2所示。在262 nm檢測波長下，相對校正因子分別為f大豆苷/黃豆黃苷=1.078 6，f大豆苷/染料木苷=1.918 5，f大豆苷/大豆苷元=1.897 2，f大豆苷/黃豆黃素=3.070 0，f大豆苷/染料木素=3.168 4，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為1.10%、1.85%、1.76%、1.40%和0.56%，RSD均＜2.0%，表明實(shí)驗結(jié)果平行性較好[22]。

2.1.4 精密度 對同一混合對照品溶液進(jìn)行精密度試驗，結(jié)果顯示大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素RSD值分別為0.90%、0.90%、0.88%、0.85%、0.87%和 1.12%， 表明本方法精密度良好。

圖2 6個質(zhì)量濃度梯度的混合對照品色譜圖Fig.2 HPLC analysis of six soybean isoflavones with different concentrations

2.1.5 穩(wěn)定性 對同一混合對照品溶液進(jìn)行穩(wěn)定性試驗，結(jié)果顯示大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素RSD值分別為1.71%、1.63%、1.81%、1.75%、1.88%和 1.08%，表明該樣品在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.1.6 重復(fù)性 以腐竹為待測樣品進(jìn)行重復(fù)性試驗，采用外標(biāo)法測定腐竹中大豆苷的含量，一測多評法測定其它5種大豆異黃酮的含量。結(jié)果顯示大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素 RSD值分別為 1.13%、2.05%、2.05%、2.02%、2.19%和2.23%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率 大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素的加樣回收率分別為 102.71% 、99.57% 、100.24% 、97.36% 、99.35% 和98.14%，其 RSD分別為 0.42%，0.38%、1.64%、1.49%、2.20%和0.52%，結(jié)果表明方法的加樣回收率良好。

表1 6種大豆異黃酮的回歸方程及線性范圍（262 nm）Table 1 Regressive equations and liner range of six soybean isoflavones

表2 大豆苷對其他5種大豆異黃酮的校正因子Table 2 RCF of daidzein to 5 other soybean isoflavones

2.2 耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性評價

2.2.1 不同色譜柱及高效液相色譜儀考察 分析不同品牌液相和不同色譜柱下，大豆異黃酮之間的相對校正因子，結(jié)果如表3所示。大豆苷對于其他5種大豆異黃酮的相對校正因子的平均值為f大豆苷/黃豆黃苷=1.114 1，f大豆苷/染料木苷=1.950 0，f大豆苷/大豆苷元=1.876 4，f大豆苷/黃豆黃素=3.083 7，f大豆苷/染料木素=3.257 4，其RSD值分別為 2.26%、1.83%、2.22%、2.66%、和2.77%，均小于3%，表明本方法適用范圍廣，可適用于不同的儀器和色譜柱，便于推廣應(yīng)用。

2.2.2 流量與柱溫的考察 不同流量的條件下對6種大豆異黃酮進(jìn)行HPLC分析，計算大豆苷對于其他5種大豆異黃酮的相對校正因子的RSD值，分別為0.06%、0.14%、0.14%、0.12%和0.25%；在不同溫度的條件下HPLC分析發(fā)現(xiàn)，5種大豆異黃酮的相對校正因子RSD值分別為0.15%、0.06%、0.15%、0.13%和0.21%。實(shí)驗結(jié)果表明，HPLC分析時的流量、柱溫對6種大豆異黃酮的一測多評分析中相對校正因子的影響極小。

2.2.3 大豆異黃酮色譜峰的指認(rèn) 在僅使用1個對照品時，如何指認(rèn)待測樣中其他5種大豆異黃酮的色譜峰是影響一測多評法高效性、準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。目前，一測多評分析過程中通常采用相對保留時間差、光譜相關(guān)色譜進(jìn)行色譜峰指認(rèn)[14]。作者通過計算大豆異黃酮與內(nèi)參物大豆苷的相對保留時間，以及262、248 nm下色譜峰面積的比值，從而判斷其他5種待測大豆異黃酮色譜峰的準(zhǔn)確位置。

在改變儀器型號、色譜柱型號、流量、柱溫等條件下，分別考察相對保留值和保留時間差在不同品牌儀器和不同品牌色譜柱中的重現(xiàn)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)保留時間差的波動較為明顯，相對保留值的波動相對較小，采用相對保留值法進(jìn)行大豆異黃酮類成分色譜峰的定位較為可行。在3個不同品牌高效液相色譜儀和3根不同品牌色譜柱的條件下，其他5種大豆異黃酮對于大豆苷的相對保留時間分別為T黃豆黃苷/大豆苷=1.10，T染料木苷/大豆苷=1.38，T大豆苷元/大豆苷=2.32，T黃豆黃素/大豆苷=2.47，T染料木素/大豆苷=2.85，如下表 4 所示。 在不同流量條件下，其相對保留時間分別為1.10、1.43、2.41、2.51和2.93。在不同溫度條件下，其相對保留時間分別為 1.09、1.42、2.34、2.44 和 2.88。在檢測條件變動情況下，相對保留時間的RSD均＜5%，表明改變這些條件對其相對保留時間的影響不大。

另外，在雙波長的檢測條件下，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素的平均相對峰面積比值 A262/248分別為 0.95、1.20、1.42、0.76、1.08 和 1.50，如下表 5 所示。因此，可以在相對保留時間基礎(chǔ)上，參照雙波長下的峰面積比值對大豆異黃酮的色譜峰進(jìn)行準(zhǔn)確指認(rèn)。

表3 不同品牌液相和不同色譜柱測得的相對校正因子Table 3 RCF of daidzein to 5 other soybean isoflavones in different HPLC instruments and columns

表4 不同儀器色譜柱測得的相對保留時間Table 4 Relative retention time in different instruments and columns

2.3 一測多評法準(zhǔn)確性評價

以6份腐竹提取液為待測樣品，分別采用外標(biāo)法和一測多評法測定提取液中6種大豆異黃酮的含量，結(jié)果分別如表6所示。計算其他5種大豆異黃酮的一測多評計算含量與外標(biāo)法實(shí)測含量的夾角余弦值，分別為0.999 98，1.000 00，0.999 99，0.999 98和0.999 99，表明2種方法測得的含量沒有顯著性差異，所建立的一測多評分析方法有良好的準(zhǔn)確性。

表5 262 nm與248 nm波長下峰面積的比值Table 5 Peak area ratio of 262 nm to 248 nm

表6 外標(biāo)法與一測多評法測定腐竹中6種異黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 6 Contents of six isoflavones in yuba determined by external standard method and QAMS （μg/g）

2.4 一測多評法的再驗證與應(yīng)用

對腐竹、豆腐干、千張、大豆和豆腐等豆制品提取液進(jìn)行HPLC分析，采用一測多評法計算6種大豆異黃酮的含量，結(jié)果見圖3。此外，采用外標(biāo)法計算和驗證5種豆制品中大豆異黃酮的含量，按公式6計算兩種測定方法下的相對誤差，結(jié)果顯示黃豆黃苷的測定相對誤差為0.06%～1.43%，染料木苷的測定相對誤差為0.57～3.65%，大豆苷元的測定相對誤差為0.95%～3.72%，黃豆黃素的測定相對誤差為0.85%～3.95%，染料木素的測定相對誤差為0.07%～2.74%。參考周園等的研究[23]，比較一測多評法與外標(biāo)法的相對誤差小于5%，說明建立的一測多評分析方法測定結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性和可信度。

對選取的豆制品中大豆異黃酮含量測定結(jié)果表明，豆制品中大豆異黃酮以染料木苷、大豆苷為主，異黃酮苷元含量相對較低，豆腐干中大豆異黃酮的含量高于其他豆制品。研究表明，大豆異黃酮在加工過程中不同組分間易發(fā)生轉(zhuǎn)化，如加熱導(dǎo)致大豆異黃酮苷分解成苷元[8]。此外，不同氣候、產(chǎn)地等因素，也是導(dǎo)致豆制品原料中大豆異黃酮含量差異的重要因素。目前，國內(nèi)對豆制品中不同大豆異黃酮的定量分析不多，系統(tǒng)評價日常膳食中大豆異黃酮的含量，是分析居民大豆異黃酮日攝入量與健康相關(guān)性的重要數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，而一測多評分析技術(shù)可極大促進(jìn)膳食營養(yǎng)素、功能因子的含量測定。

圖3 一測多評法測定豆制品中大豆異黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.3 Contents of soybean isoflavones in bean products determined by QAMS

3 結(jié) 語

膳食中的天然功能因子，如黃酮、酚酸等，許多以系列衍生物的形式存在，具有結(jié)構(gòu)共性和差異性。通過分析黃豆苷元、黃豆苷、染料木素、染料木苷、黃豆黃素、黃豆黃苷等6種大豆異黃酮在高效液相色譜行為學(xué)上的差異，基于它們的結(jié)構(gòu)共性，尋找在色譜行為學(xué)及光譜學(xué)上的內(nèi)在聯(lián)系，研究建立了6種大豆異黃酮的一測多評方法。通過大量實(shí)驗數(shù)據(jù)建立了6種大豆異黃酮間的相對校正因子（262 nm，f大豆苷/黃豆黃苷=1.114 1，f大豆苷/染料木苷=1.950 0，f大豆苷/大豆苷元=1.876 4，f大豆苷/黃豆黃素=3.083 7，f大豆苷/染料木素=3.257 4），以相對保留時間（T黃豆黃苷/大豆苷=1.10，T染料木苷/大豆苷=1.38，T大豆苷元/大豆苷=2.32，T黃豆黃素/大豆苷=2.47，T染料木素/大豆苷=2.85）和相對峰面積（A262/248分別為 0.95，1.20，1.52，0.83，1.08，1.50）對大豆異黃酮的色譜峰進(jìn)行了準(zhǔn)確指認(rèn)。

對建立的一測多評方法進(jìn)行了方法學(xué)驗證，研究表明本方法精密度高，供試品穩(wěn)定良好，結(jié)果重復(fù)性及加樣回收率高，耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性均表現(xiàn)良好，在不同型號儀器、色譜柱、流量、柱溫等條件下均可進(jìn)行，便于推廣。對日常豆制品中異黃酮含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明一測多評法測定結(jié)果與外標(biāo)法結(jié)果相對誤差小，所建立的一測多評法測定結(jié)果準(zhǔn)確，可用于大豆異黃酮的快速定量分析及相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量評價。