脂肪酸鈣對應激肉雞氧化還原狀態和免疫功能的影響

王 瑩， 劉子微， 朱建津*， 蔣 蓉

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.無錫三智生物科技有限公司，江蘇 無錫 214155）

高密度飼養的廣泛應用，使得家禽在飼養過程中面臨各種應激。適當應激有利于機體度過短期惡劣環境，但長期慢性應激會使能量過度消耗，激素分泌紊亂，甚至導致疾病的發生[1-3]。機體應激主要表現為以HPA軸（下丘腦-垂體-腎上腺軸）興奮為主的一系列神經內分泌反應，過度應激使內環境穩態受到威脅，氧化還原失衡，免疫功能紊亂[4-5]。我國在肉雞飼料中通常添加大豆油和豬油作為脂肪來源，飼料級豬油因成本較低成為更多工廠的選擇，但這種豬油通常會出現一定程度的氧化，攝入之后會影響肉雞正常的生理功能，造成機體應激[6-8]。脂肪酸鈣是一種新型的脂肪來源，它可通過油脂加工過程中產生的副產物加含鈣化合物制成，常作為過瘤胃脂肪來源用于反芻動物日糧中[9]。有研究者發現脂肪酸鈣可以代替部分油脂作為肉雞的能量補充飼料，不影響生產性能指標，同時可降低飼料的生產成本,是較為理想的飼料油脂替代品[10]。但脂肪酸鈣與甘油三酯結構不同，在體內的消化過程也不同，其對肉雞機體氧化還原狀態和免疫功能的影響未見報道[11]。因此，作者在肉雞基礎日糧中添加脂肪酸鈣，研究其對應激肉雞氧化還原狀態和免疫功能的影響，為脂肪酸鈣在黃羽肉雞日糧中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

豆油為市售食用級4級大豆油，PV值3.93，豬油為市售飼料級豬油，PV值10.62，脂肪酸鈣為大豆油脂肪酸鈣，純度為80%，脂肪質量分數75%，鈣質量分數9%。實驗動物為1日齡中速三黃肉雞（浙江綠園禽業有限公司提供），經動物衛生監督所檢驗合格。

1.2 實驗試劑

雞CRH （促腎上腺皮質激素釋放激素）、雞ACTH(促腎上腺皮質激素)、雞CORT（皮質酮）試劑盒、雞IgG（免疫球蛋白G）試劑盒、雞IgA（免疫球蛋白 A）試劑盒、IL-6（白介素-6）試劑盒、雞 HSP70（熱休克蛋白70）試劑盒：廈門慧嘉生物科技有限公司產品；CAT（過氧化氫酶）試劑盒，MDA（丙二醛）試劑盒，SOD（超氧化物歧化酶）試劑盒：南京建成生物工程研究所產品；總蛋白定量（BCA法）試劑盒：上海碧云天生物技術有限公司產品。指標測定嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3 動物分組與飼養

將360羽一日齡中速黃羽肉雞隨機分為4組：正常對照組（Ⅰ組）和應激組（Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組）,每組9個重復欄,每欄10羽。各組飼料中添加的油脂分別為豆油（Ⅰ組）、豆油（Ⅱ組）、飼料級豬油（Ⅲ組）、豆油脂肪酸鈣（Ⅳ組）。對照組為平養模式，按常規飼養模式控溫，第一周35℃，之后每周降2℃，直至溫度維持在24℃。應激模型為高溫高密度籠養應激模型，應激組每只雞占籠位面積約390 cm2，飼養溫度維持在35℃。兩組都在肉雞進舍之前，用福爾馬林和高猛酸鉀對雞舍進行熏蒸消毒，實驗周期63 d，常規免疫和飼養管理。

實驗飼料配方：根據三黃雞的營養需要配制，飼料配方見表1。

表1 基礎日糧配方Table 1 Composition of the basal diet

1.4 試驗樣品采集與測定

63 d實驗期結束時，每組隨機抽取9羽黃羽雞，共36羽進行實驗各指標檢測分析。取靜脈血入采血管中，4℃，3 000 r/min離心10 min，取上層血清，-80℃保存備用。取血入抗凝采血管中，4℃，3 000 r/min離心10 min，取上層血漿，-80℃保存備用。取肝臟、空腸、十二指腸加入預冷的生理鹽水勻漿制得質量分數10%組織勻漿，離心10 min后取上清液，-80℃保存，用于測定各項生化指標。

1.5 主要試驗設備

綜合Epoch微孔板分光光度計：美國Biotek公司產品；臺式高速冷凍離心機5804R：Eppendorf公司產品；R686VLT超低溫冷凍冰箱：美國 INVETRO公司產品；電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療儀器儀表廠產品；Mettle Toledo AB204-N電子天平、Mettler Toledo 320pH計：梅特勒-托利多儀器 （上海）有限公司產品；XB70制冰機：美國GRANT公司產品；恒溫水浴鍋：精宏實驗設備有限公司產品。

1.6 數據的處理和統計分析方法

實驗數據采用SPSS19.0對數據進行方差分析，結果以平均值±標準差表示，顯著水平為P＜0.05，極顯著水平為P＜0.01，采用GraphPad Prism 5.01軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 脂肪酸鈣對應激肉雞應激相關指標的影響

由圖1可知，與對照組相比，Ⅱ組和Ⅲ組肉雞血漿 CRH、ACTH、CORT質量濃度顯著升高 （P＜0.05），且Ⅲ組肉雞血漿ACTH極顯著高于對照組（P＜0.01）。 在應激組中，Ⅲ組肉雞血漿 CRH、ACTH、CORT質量濃度顯著高于其他組（P＜0.05），其中血漿CORT質量濃度極顯著高于Ⅳ組（P＜0.01）。Ⅳ組肉雞血漿ACTH、CORT含量顯著低于Ⅱ組和Ⅲ組（P＜0.05）且接近Ⅰ組。HPA軸是神經內分泌免疫網絡的樞紐，是應激反應的核心反應軸路[12-13]。當應激發生時，HPA軸被激活，機體血漿CRH、ACTH和CORT升高[14-15]。實驗結果表明，綜合應激使肉雞HPA軸相關激素質量濃度上升，飼料級豬油加劇肉雞機體應激狀況，而脂肪酸鈣能有效地改善肉雞機體應激狀況，并且部分相關激素能恢復至正對照組的水平。

圖1 脂肪酸鈣對應激肉雞HPA軸激素的影響Fig.1 Effect of fatty acid calcium on HPA axis hormone in stressed broiler chickens

由圖2可知，應激組肉雞血漿、肝臟和空腸HSP70質量濃度均顯著（P＜0.05）高于對照組，其中Ⅱ組和Ⅲ組肉雞肝臟HSP70質量濃度極顯著高于對照組（P＜0.01）。應激組中，Ⅲ組肝臟與血漿HSP70質量濃度顯著高于Ⅱ組和Ⅳ組（P＜0.05），Ⅲ組空腸HSP70質量濃度極顯著高于Ⅳ組（P＜0.01）；Ⅳ組肉雞空腸、血漿HSP70質量濃度顯著低于Ⅱ組和Ⅲ組（P＜0.05）。 熱休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）是生物在多種應激源作用下均可產生的一組保護性蛋白，用于增強細胞對損害的耐受程度，抵抗過度應激所造成的組織細胞損傷[16]。HSP70是HSPs家族中最重要的一員，在應激狀態下的細胞中合成最為顯著[17]。實驗結果表明脂肪酸鈣可抑制機體HSP70的過量表達，緩解過度應激對機體產生的負面影響。

圖2 脂肪酸鈣對應激肉雞HSP70的影響Fig.2 Effect of fatty acid calcium on HSP70 in stressed broiler chickens

2.2 脂肪酸鈣對應激肉雞氧化還原狀態的影響

如圖3所示，與對照組相比，應激組CAT活力顯著降低（P＜0.05），Ⅲ組血清CAT活力極顯著低于對照組（P＜0.01）。應激組中，Ⅱ組和Ⅳ組血清CAT活力顯著高于Ⅲ組（P＜0.05），Ⅳ組肝臟CAT活力顯著高于Ⅲ組（P＜0.05），且十二指腸CAT活力極顯著高于Ⅲ組（P＜0.01）。CAT可以清除生物體內的過氧化氫，抑制體內羥基自由基的形成，進而提高機體的抗氧化能力[18]。試驗結果表明，綜合應激使肉雞體內CAT活力降低，脂肪酸鈣可以提高應激肉雞體內CAT活力。

圖3 脂肪酸鈣對應激肉雞CAT活力的影響Fig.3 Effect of fatty acid calcium on CAT activity in stressed broiler chickens

如圖4所示，與對照組相比，應激組肉雞MDA含量升高，Ⅱ組和Ⅲ組血清MDA含量極顯著高于對照組（P＜0.01）。應激組中，與Ⅲ組相比，Ⅱ組肝臟和十二指腸MDA含量顯著降低（P＜0.05），但血清MDA含量差異不顯著。Ⅳ組血清、肝臟和十二指腸MDA含量顯著低于Ⅲ組（P＜0.05），肝臟MDA含量顯著低于Ⅱ組且與對照組無顯著性差異。MDA是脂質過氧化物代謝過程中形成的小分子產物，其含量常被用作機體組織細胞脂質過氧化程度的生物標志物，過量的MDA會引起膜脂、膜蛋白交聯，使膜蛋白構象發生改變，影響細胞的各種功能[19-21]。試驗結果表明，綜合應激使肉雞體內脂質過氧化程度升高，脂肪酸鈣可以改善這種情況的發生。

圖4 脂肪酸鈣對應激肉雞MDA含量的影響Fig.4 Effect of fatty acid calcium on MDA content in stressed broiler chickens

如圖5所示，與對照組相比，應激組肉雞總SOD活力降低，Ⅲ組血清、肝臟、十二指腸總SOD活力顯著低于對照組（P＜0.05）。應激組中，與Ⅲ組相比，Ⅱ組肝臟和十二指腸總SOD活力顯著升高（P＜0.05），但血清總SOD活力差異不顯著。Ⅳ組血清、肝臟和十二指腸總SOD活力顯著高于Ⅲ組 （P＜0.05），肝臟總SOD活力與對照組無顯著性差異。SOD是生物體中的最重要的抗氧化酶之一，它可以催化氧自由基鏈中超氧自由基生成過氧化氫，是機體中天然存在的超氧自由基清除因子，SOD活性的高低反映了組織細胞清除超氧陰離子的能力[19-20]。試驗結果表明，綜合應激使肉雞體內SOD活性降低，脂肪酸鈣相較飼料級豬油可以提高應激肉雞體內SOD活力。

圖5 脂肪酸鈣對應激肉雞總SOD活力的影響Fig.5 Effect of fatty acid calcium on T-SOD activity in stressed broiler chickens

2.3 脂肪酸鈣對應激肉雞免疫功能的影響

如圖6所示，與對照組相比，Ⅱ組血漿、空腸IgG含量顯著降低（P＜0.05），Ⅲ組血漿IgG含量極顯著降低（P＜0.01），Ⅳ組血漿、空腸IgG含量無顯著性差異。應激組中，Ⅱ組空腸IgG含量顯著高于Ⅲ組（P＜0.05），Ⅳ組血漿 IgG 含量顯著高于Ⅲ組（P＜0.05）。IgG是再次免疫應答產生的主要免疫球蛋白，是機體發生體液免疫的“主力軍”，IgG能通過結合補體、中和毒素、增強免疫細胞吞噬功能調節免疫功能，在介導抗體依賴性細胞毒性中也發揮著重要作用[22-23]。實驗結果表明，綜合應激使肉雞體內IgG含量下降，脂肪酸鈣能提高應激肉雞體內IgG含量。

圖6 脂肪酸鈣對應激肉雞IgG的影響Fig.6 Effect of fatty acid calcium on IgG content in stressed broiler chickens

圖7 脂肪酸鈣對應激肉雞IgA的影響Fig.7 Effect of fatty acid calcium on IgA content in stressed broiler chickens

如圖7所示，與對照組相比，Ⅱ組血漿IgA、空腸 sIgA含量顯著降低（P＜0.05），Ⅲ組空腸 sIgA含量極顯著降低（P＜0.01），Ⅳ組血漿IgA、空腸sIgA含量無顯著性差異。應激組中，Ⅳ組血漿IgA含量顯著高于Ⅲ組（P＜0.05），空腸sIgA含量極顯著高于Ⅲ組（P＜0.01）。sIgA是腸道粘膜免疫最重要的免疫效應分子，含量占黏膜相關組織產生所有抗體的80%以上，其獨特的分泌成分能阻礙微生物的黏附，從而發揮對粘膜的保護作用[24]。實驗結果表明，綜合應激使肉雞體內IgA含量下降，飼料級豬油加劇了IgA含量的降低，脂肪酸鈣能提高應激肉雞體內IgA含量。

圖8 脂肪酸鈣對應激肉雞IL-6的影響Fig.8 Effect of fatty acid calcium on IL-6 content in stressed broiler chickens

如圖8所示，與對照組相比，應激組肉雞IL-6含量升高，Ⅲ組血漿IL-6含量極顯著升高 （P＜0.01）。應激組中，與Ⅲ組相比，Ⅱ組血漿、空腸IL-6含量顯著降低 （P＜0.05），肝臟IL-6含量差異不顯著。Ⅳ組血漿、肝臟IL-6含量顯著低于Ⅲ組 （P＜0.05），空腸IL-6含量極顯著低于Ⅲ組 （P＜0.01）。IL-6是機體內皮細胞、上皮細胞以及肥大細胞分泌的細胞因子之一，IL-6可以通過調節結腸上皮細胞電解質分泌、改變內皮細胞通透性引起炎癥反應[25-27]。實驗結果表明，綜合應激使肉雞體內IL-6含量上升，脂肪酸鈣能夠緩解應激肉雞IL-6的升高。

3 討論

應激反應、機體氧化還原狀態、免疫功能三者之間有著密切的關系[28]。免疫功能的變化是應激反應的主要效應之一，免疫反應與HPA軸之間具有雙向的交流通路[24]。Tarcic等發現束縛應激導致小鼠胸腺退化，CD4+胸腺細胞亞群減少，胸腺DNA斷裂，且內源性糖皮質激素參與了對胸腺的抑制作用[29]。Regnier等發現慢性熱應激和冷應激抑制了禽類體外T淋巴細胞的增殖[30]。Hangalapura等認為應激調節細胞免疫和血漿CORT的水平取決于應激的持續時間[31]。嚴重應激使肉雞抗氧化能力下降，活性氧代謝失衡，當細胞積累的活性氧超過正常生理代謝所需含量時，活性氧就會通過抑制轉錄使蛋白質表達異常；從而引起免疫功能的變化[32]。Lin等研究發現，急性熱應激可誘導5周齡肉雞氧化應激，肝臟比心臟更容易發生氧化應激[33]。Zhao等研究發現，應激影響免疫器官中抗氧化酶的活性，急性應激使雛雞T-AOC活性顯著降低，免疫器官中MDA水平升高，Hsps表達水平顯著增加[34]。Chi等認為應激通過NF-κB信號通路介導炎癥反應，使ROS含量升高引發氧化失衡，其共同作用損害雞外周血淋巴細胞[35]。本實驗中應激導致肉雞HPA軸相關激素含量上升，體內抗氧化能力降低，免疫功能受損等與前人研究結果一致。

脂肪酸鈣與普通油脂消化吸收方式不同，它在胃中分解為游離脂肪酸，在腸道中部分游離脂肪酸合成為甘油一酯，從而發揮乳化劑的作用，提高了脂肪的利用率[36]。過度應激會使脂肪酶活性下降，機體消化吸收能力降低，代謝紊亂[37]，這時脂肪酸鈣在消化吸收方式上的不同成為一大優勢，增強了肉雞對脂肪的消化能力，為機體提供充足的能量和必需脂肪酸，提高了肉雞的抗應激能力。劉艷琴等發現脂肪酸鈣對奶牛的熱應激有一定的抵抗作用，這種作用與脂肪酸鈣的添加量有關[38]。本試驗中，Ⅳ組采用的是脂肪酸鈣完全替代油脂的飼喂方法，脂肪酸鈣部分代替油脂飼喂肉雞是否會有更好的結果還需進一步實驗確定。

4 結 語

綜上所述，集約化養殖使肉雞處于應激狀態，體內抗氧化能力降低，免疫功能下降。飼料級豬油加劇了應激的負面影響，脂肪酸鈣可以改善應激肉雞體內的氧化還原狀態，緩解應激對肉雞免疫功能的不利影響，增強抗應激能力。