安化黑茶對載脂蛋白E敲除小鼠動脈粥樣硬化的影響

張文將， 易 健， 賈 平， 陳博威， 韓鵬鵬， 徐 睿， 劉柏炎*

（1.湖南中醫藥大學 第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.益陽醫學高等專科學校，湖南 益陽 413000）

據中國心腦血管病報告統計顯示，心腦血管疾病已經占據中國城鄉居民死亡的首位，近年居高不下且呈現上升趨勢[1]。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導致各種心腦血管疾病形成的重要病理學基礎[2]，引起AS形成的具體機制目前尚不清楚，傳統觀念認為高脂血癥、高血壓和高血糖、抽煙及遺傳因素的是誘發AS發生的危險因素，隨著科學研究的逐步深入，越來越多的學者認為炎癥與AS的發生密切相關[3-4]，炎癥反應幾乎參與了AS發生發展的全過程[5]，自從ROSS首先提出炎癥學說以來，經過大量的臨床和動物實驗的驗證，“炎癥學說”目前已成為導致AS發生的主流學說之一。阿托伐他汀是臨床上應用于治療AS的常用藥物，但是長期服用所帶來的不良反應也限制了其的廣泛應用。為此大量的科學家試圖尋找一種能夠降脂、抗炎、保護血管內皮細胞的藥物或者藥食同源的食物，以期從根本上抑制AS的發生發展。

中國茶文化源遠流長，茶作為日常飲品，在人們的日常生活中具有舉足輕重的作用?！侗静菔斑z》提出“茶為萬病之藥”的觀點。綠茶富含茶多酚，茶多酚具有降脂、抗氧化、抗炎、改善血管內皮、增強一氧化氮產生的功能，從而起到較好的防治AS的作用[6-9]。但是綠茶性寒，并且富含鞣質、脾胃虛寒的患者、秋冬寒涼季節均不宜飲用。黑茶作為一種后發酵茶，不僅含有茶多酚，并且在長時間渥堆發酵的過程中有諸多微生物參與茶葉物質的轉化，同時在這個發酵過程中也產生了茶色素等不同于其他茶葉的成分。茶色素具有較好的調節血脂代謝紊亂和顯著的抗脂質過氧化、清除自由基及抗凝、促纖溶作用[10]。茯磚茶屬于安化黑茶中的特色茶葉，在其發花過程所產生的優勢真菌冠突散囊菌具備一定的自由基清除能力，同時其分泌的兒茶素衍生物等具備比茶多酚更強的抗氧化能力，是醫學領域具有很大優勢的微生物[11-13]。有研究發現冠突散囊菌液體發酵物的結構與降脂藥物洛伐他汀相似[14]。課題組前期已有的實驗證實安化黑茶中的茯磚茶對于高脂血癥大鼠具有降脂、抗炎的作用，可降低大鼠主動脈腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的表達水平[15]；抑制高脂血癥大鼠主動脈核轉錄因子NF-κB（nuclear factor，NF-κB）蛋白質和基因的表達[16]。 茯磚茶中的成分具有抗炎、抗氧化、降脂和保護血管內皮細胞的作用，需要通過動物實驗來進一步驗證。

載脂蛋白E（APOE）參與血中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）的轉運與清除，在脂蛋白的代謝中發揮著重要的作用[17]。載脂蛋白E基因敲除（APOE-/-）小鼠完全缺失APOE，導致血漿中的低密度脂蛋白膽固醇 （low density lipoprotein，LDL）、 （very low density lipoprotein，VLDL）、乳糜微粒等物質清除能力受損，引起血漿中的膽固醇水平的升高[18]，為此APOE-/-小鼠是目前研究AS最為廣泛的理想動物模型，作者采用APOE-/-小鼠復制AS模型，觀察安化黑茶中的茯磚茶對于AS干預的效果，以期為深入研究安化黑茶抗AS的機制研究提供更多的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 8周齡APOE-/-雄性小鼠55只，體質量（25±5）g，SPF級，購自于南京大學生物模式中心，動物許可證號為SCXK（蘇）2015-0001，品系名APOE Cas9-KO，品系編號T001458，配繁信息為-82bp/wt配B6J，遺傳背景C57BL/6，基因型：（APOE）KO/KO；8 周齡 C57BL/6J野生型雄性小鼠10只，動物許可證號 SYXK（湘）2016-0002；本實驗通過湖南中醫藥大學倫理委員會審查，動物倫理批準號為20171001，實驗單位許可證編號SYXK（湘）2013-0005。

1.1.2 藥物及試劑 天茯茶：湖南省白沙溪茶廠饋贈；阿托伐他?。ㄒ幐瘢?0 mg，批號 110590）：輝瑞制藥有限公司產品。生理鹽水、多聚甲醛（biosharp）、水合氯醛：天津市科密歐化學試劑有限公司產品；mouse氧化型低密度脂蛋白 （oxidized low-density lipoprotein，OX-LDL） ELISA Kit、mouse TNF-α ELISA Kit、mouse 白細胞介素-1β（interleukin1β，IL-1β） ELISA Kit、mouse 高敏感性 C-反應蛋白（high-sensitivity CRP，hs-CRP）ELISA Kit、mouse 單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）ELISA Kit試劑盒：武漢基因美生物科技有限公司產品；蘇木素染色液：北京中杉金橋生物技術有限公司產品；伊紅染色液：北京中杉金橋生物技術有限公司產品。

1.1.3 飼料配方 西方飲食飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產許可證號：SCXK（京）2014-0008，型號：H10141（脂肪 21%，0.15%膽固醇，具體配方：酪蛋白、蛋氨酸、玉米淀粉、麥芽糖糊精、纖維素、玉米油、無水奶油、礦物質混合物、碳酸鈣、維生素混合物、膽固醇）。

1.1.4 主要儀器 體式顯微鏡、光學顯微鏡：日本奧林巴斯公司產品；超低溫冰箱：海爾股份有限公司產品；全自動生化分析儀：貝克曼庫爾特公司產品；高速冷凍離心機：德國Hermle公司產品；超純水機：上海摩勒科學儀器有限公司產品；生物組織自動脫水機：亞光醫用電子技術公司產品；石蠟包埋機：德國LEICA儀器公司產品；石蠟切片機：德國LEICA儀器公司產品；恒溫干燥箱：福碼實驗設備有限公司產品；多功能酶標儀：perkinelmer公司產品；電熱蒸汽滅菌器：美國ZEALWAY公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物制備 按照黑茶推薦成人飲用量干茶10 g/d的劑量來換算實驗動物所需劑量 （以60 kg人的體質量和20 g小鼠體質量作為參考，查閱實驗動物與人的體表面積比值表進行換算）。將白沙溪天茯茶用茶刀切取適量，帶無菌手套將其掰成小塊狀稱量，用無菌紗布包裹并放入燒杯中，將實驗室所用III級水加入燒杯中浸泡30 min，隨后將燒杯放石棉網上用實驗電爐進行加熱，武火煮沸之后改為文火煎煮30 min左右，將濃縮藥液倒出，黑茶殘渣加水繼續煎熬，將兩次藥液濃縮所需體積，4 000r/min離心15 min后，取上清液無菌紗布過濾后冷卻放入消毒磨口瓶，4℃冰箱保存備用。為防止藥液變質，每次所濃縮的藥量為1周左右。黑茶高劑量組用藥2.16 g/kg、黑茶中劑量組用藥1.44 g/kg、黑茶低劑量組用藥0.72 g/kg。阿托伐他汀用量為10 mg/kg，每次將20 mg的藥片放入研缽內用研杵碾碎，加入生理鹽水溶解灌胃，現配現用。

1.2.2 小鼠飼養 實驗小鼠飼養于湖南中醫藥大學SPF級實驗動物中心獨立通氣籠盒（IVC）中，溫度（24±0.5） ℃，相對濕度（50%～70%），壓差 20 Pa，晝夜光照節律。空白對照組予以普通生長飼料（湖南斯萊克景達實驗動物公司提供）；模型組和藥物組采用西方飲食輻照飼料，飼料低溫保存；為保證小鼠進食的相對一致，每天定量予以飼料供應。飲水為III水，墊料更換次數為一周兩次，在更換墊料的同時用84消毒浸泡籠具，自來水沖洗晾干備用，每日補充飼料及水。

1.2.3 動物分組、造模與給藥 選取8周齡雄性APOE-/-小鼠55只，持續西方飲食喂養13周，同時選用8周齡的C57小鼠作為空白對照予以普通飼料喂養13周[19-21]，13周后隨機抽取5只行HE染色，確定造模成功后根據體質量分層，然后隨機分為模型組、阿托伐他汀組和安化黑茶高、中、低劑量組。分組后的APOE-/-小鼠繼續西方飲食喂養8周，同時每天上午9點左右予以相應的藥物連續灌胃干預8周。阿托伐他汀組予以10 mg/（kg·d）藥物灌胃給藥、現配現用；黑茶高劑量組用藥2.16 g/（kg·d）、黑茶中劑量組用藥 1.44 g/（kg·d）、黑茶低劑量組用藥 0.72 g/（kg·d）；空白組和模型組予以等劑量的生理鹽水灌胃。

1.2.4 標本收集與處理 各組小鼠于灌胃第8周末禁食不禁水12 h后，依次進行以下操作：（1）將小鼠麻醉后摘眼球取血，室溫靜止2小時后將血液置于無菌EP管中4℃12 000g離心15 min，分離血清，-80℃分裝保存用于血脂和炎癥指標的檢測，血清避免反復凍融。（2）脫臼處死小鼠，將小鼠胸腹腔剪開，放到冰盒或者冰塊上操作，迅速摘取小鼠肝臟進行稱量，生理鹽水清洗后濾紙拭干，切除小鼠同一部位肝臟組織放入多聚甲醛中以備蘇木精-伊紅染色；摘除脾臟，清除脂肪組織后稱重；迅速抽取10 mL冰生理鹽水配1 mL針頭心尖部進行心臟灌注，完畢后將小鼠動脈組織轉移到放有碎冰的培養皿中，體式顯微鏡工作臺下操作，用眼科剪快速仔細的剔除動脈管壁上的脂肪組織，將心臟連同0.5～1.0 cm的主動脈弓部位眼科剪剪下后進行沖洗，轉移到體積分數4%的多聚甲醛中，剩余動脈放入凍存管中液氮速凍，之后轉移至-80℃凍存待測，最后分離腹部脂肪組織進行稱質量。固定組織后在4℃冰箱內過夜，24小時后常規脫水、石蠟包埋并連續切片，切片厚度5 μm制作石蠟切片，HE常規染色后，于光學顯微鏡下觀察主動脈病理形態的變化。

1.2.5 檢測指標和方法

1）血脂四項檢測 將100UL小鼠血清和雙蒸水1∶1稀釋混勻后送到益陽醫專附屬醫院檢驗科，采用貝克曼庫爾特AU680全自動生化分析儀進行檢測。

2） 血清中 OX-LDL、MCP-1、TNF-α、hs-CRP、IL-1β水平的測定 采用酶聯免疫分析法（ELISA）進行測定，測試樣本前提前30 min打開酶標儀進行預熱，用多功能酶標儀450nm光波下進行檢測相關OD值，參照說明書中標準品的濃度繪制標準曲線，將OD值代入曲線方程中，計算出樣品的濃度，對于所得濃度運用統計學軟件進行數據分析。

1.2.6 統計學處理 將實驗所得數據運用SPSS18.0統計學軟件進行分析，采用單因素方差分析的統計學方法來比較多組間均數，針對組間兩兩比較齊者的數據進行LSD檢測，P＜0.05說明差異具有統計學意義。

圖1 小鼠主動脈瓣膜附近蘇木精-伊紅染色形態學圖片Fig.1 Morphological pictures of hematoxylin-eosin staining near mouse aortic valve

2 結果與分析

2.1 HE染色結果

圖1為HE染色結果?？瞻讓φ战M（圖A：40X；圖B：100X）：小鼠動脈管壁光滑完整，瓣膜及管壁附近無斑塊附著，管腔中空，內、中、外膜結構完整，層次清晰；模型組（圖 C：40X；圖 D：100X）：小鼠動脈管壁內膜及瓣膜明顯增厚，管壁附著有大量的斑塊，主要成分為大量的膽固醇結晶及泡沫細胞，中膜平滑肌受壓變薄，管腔明顯狹窄；阿托伐他汀組（圖E：40X；圖F：100X）：小鼠動脈管壁附著有斑塊，主要成分為膽固醇結晶及泡沫細胞，瓣膜無明顯增厚現象，斑塊附近的中膜平滑肌受壓變薄，管腔狹窄程度小于模型組；黑茶高劑量組（圖G：40X；圖H：100X）：小鼠動脈管壁有斑塊附著，呈現偏心狀分布，主要成分以泡沫細胞為主，瓣膜無明顯增厚，管腔面積有所狹窄；黑茶中劑量組（圖I：40X；圖J：100X）：動脈管壁周圍的斑塊呈現偏心狀分布，管腔面積有所狹窄，斑塊主要成分以泡沫細胞為主，瓣膜無明顯增厚；黑茶低劑量組（圖K：40X；圖L：100X）：動脈粥樣斑塊附著于主動脈管壁一側，呈現偏心狀分布，管腔面積減少，中膜平滑肌受壓變薄，主要成分為大量的膽固醇結晶及泡沫細胞為主。

2.2 實驗小鼠體質量、肝質量、腹部脂肪質量與肝指數的比較

表1顯示：與模型組相比，空白組、黑茶高、中、低劑量組小鼠的體質量、肝質量、腹部脂肪質量、肝指數均降低（P＜0.05）。

表1 小鼠體質量、肝質量、腹部脂肪質量、肝指數的比較（±SD，n=10）Table 1 The weights of body,liver,spleen,abdominal fat and the live index in mice

表1 小鼠體質量、肝質量、腹部脂肪質量、肝指數的比較（±SD，n=10）Table 1 The weights of body,liver,spleen,abdominal fat and the live index in mice

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組相比，△P＜0.05；與阿托伐他汀相比，●P＜0.05，下同

組別肝指數/%體質量/g 肝質量/g 腹部脂肪質量/g空白組0.9 6±0.0 9△●2 4.1±1.0 8△●0.3 8±0.0 5△●3.9 3±0.3 6△模型組2.8 0±1.4 9*3 8.2±6.8 1*2.2 0±0.7 9*●5.7 6±0.9 2*●他汀組3 8.4±5.5 9*1.6 7±0.3 7*△4.3 0±0.4 3△1.4 8±0.1 5*△3 2.7±2.0 1*△●1.9 9±0.3 5△*●4.5 0±0.3 4*△中劑量3 0.8±2.5 6*△●3.1 3±1.2 8*高劑量1.3 0±0.1 5*△●4.3 0±0.3 7△1.3 8±0.4 1*△●3 3.7±2.4 2*△●低劑量1.5 7±0.1 5*2.0 6±0.1 1*△4.5 4±0.4 0*△

2.3 實驗小鼠血脂比較

表2顯示：與空白組相比，模型組小鼠血清中TC、TG、 低密度脂蛋白膽固醇 （low density lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein，HDL）的濃度升高（P＜0.05）；與模型組相比，黑茶不同劑量組TG的濃度降低（P＜0.05）；與阿托伐他汀相比，黑茶高、中劑量組TG的濃度下降、HDL 的濃度升高（P＜0.05）。

表2 小鼠血清中的 TC、TG、HDL、LDL 的比較（±SD，n=10）Table 2 The contents of TC，TG，HDL，LDL in the serum of mice

表2 小鼠血清中的 TC、TG、HDL、LDL 的比較（±SD，n=10）Table 2 The contents of TC，TG，HDL，LDL in the serum of mice

組別T C/(m m o l/L)T G/(m m o l/L)H D L/(m m o l/L)空白組2.7 3 ±0.2 6△●2.2 7±0.2 3△●0.9 7±0.3 3△●模型組5 0.5 ±4.7 5*●4.4 9±0.4 9*0.3 9±0.0 7△●1 2.1±0.5 9*●1 8.4±0.4 6*●他汀組3 5.8±5.1 4*△4.2 1±0.2 1*1 6.3±1.8 7*△1 0.0±1.0 3*△3.3 3±0.2 5*△●高劑量1 2.2±1.3 5*●4 9.5±1.4 4*●1 8.1±0.4 1*●低劑量中劑量3.1 7±0.2 6*△●1 2.3±1.2 8*●1 7.8±0.5 1*●3.9 5±0.2 7*△4 8.1±2.6 7*●4 9.6± 2.3 1*●1 1.3±1.3 7*●L D L/(m m o l/L)1 8.1±0.2 8*●

2.4 血清中 OX-LDL、MCP-1、TNF-α、hs-CRP、IL-1β的質量濃度

表3-7顯示：與空白組相比，模型組小鼠血清中 OX-LDL、MCP-1、TNF-α、hs-CRP、IL-1β 質量濃度升高（P＜0.05）；與模型組相比，阿托伐他汀和黑茶不同劑量組小鼠血清中 OX-LDL、MCP-1、TNF-α、hs-CRP、IL-1β 的質量濃度下降（P＜0.05）。

表3 小鼠血清中OX-LDL質量濃度的比較（±SD，n=10）Table 3 The content of OX-LDL in the serum of mice

表3 小鼠血清中OX-LDL質量濃度的比較（±SD，n=10）Table 3 The content of OX-LDL in the serum of mice

組別O X-L D L 質量濃度/（p g/m L）劑量鼠數/只空白組4 0.7±0.7 6△●2 0 m L/（k g·d）模型組1 0 1 0 2 0 m L/（k g·d）4 3.3±0.5 1*●他汀組1 0 m g/（k g·d）1 0 3 4.9±1.7 6*△高劑量1 0 3 4.2±2.4 7*△中劑量2.1 6 g/（k g·d）3 4.4±2.8 2*△1 0 1 0 1.4 4 g/（k g·d）低劑量0.7 2 g/（k g·d）3 5.9±1.6 6*△

表4 小鼠血清中MCP-1質量濃度的比較（±SD，n=10）Table 4 The content of MCP-1 in the serum of mice

表4 小鼠血清中MCP-1質量濃度的比較（±SD，n=10）Table 4 The content of MCP-1 in the serum of mice

組別鼠數/只劑量M C P-1 質量濃度/（p g/m L）空白組1 0 8 4.8±1.0 3△●模型組1 0 2 0 m L/（k g·d）9 1.8±3.2 8*●他汀組1 0 6 3.8±3.7 9*△1 0 m g/（k g·d）高劑量1 0 2 0 m L/（k g·d）7 9.2±4.3 3*●△1 0中劑量1.4 4 g/（k g·d）7 4.6±4.9 7*△●2.1 6 g/（k g·d）低劑量1 0 0.7 2 g/（k g·d）7 8.4±3.2 6*△●

表5 小鼠血清中TNF-α質量濃度的比較（±SD，n=10）Table 5 The content of TNF-α in the serum of mice

表5 小鼠血清中TNF-α質量濃度的比較（±SD，n=10）Table 5 The content of TNF-α in the serum of mice

組別T N F-α 質量濃度/（p g/m L）鼠數/只空白組1 0 1 6±5.2 7△●2 0 m L/（k g·d）模型組1 0劑量2 0 m L/（k g·d）1 3 4±6.8 4*●他汀組1 0 1 0 m g/（k g·d）9 6.3±6.2 0*△高劑量1 0 2.1 6 g/（k g·d）1 0 7±6.4 1*△●中劑量1 0 1.4 4 g/（k g·d）1 0 5±6.4 2*△●低劑量1 0 0.7 2 g/（k g·d）1 0 7±4.9 0*△●

表6 小鼠血清中hs-CRP質量濃度的比較（±SD，n=10）Table 6 The content of hs-CRP in the serum of mice

表6 小鼠血清中hs-CRP質量濃度的比較（±SD，n=10）Table 6 The content of hs-CRP in the serum of mice

組別h s-C R P 質量濃度/（p g/m L）鼠數/只劑量空白組1 0 2 0 m L/（k g·d）5 5 3±1 2.4△●模型組1 0 2 0 m L/（k g·d）6 2 4±2 8.7*●1 0他汀組1 0 m g/（k g·d）5 8 7±1 6.8*△高劑量2.1 6 g/（k g·d）1 0 5 0 9±3 3.2*●△中劑量1.4 4 g/（k g·d）1 0 5 3 5±2 5.4△●低劑量1 0 0.7 2 g/（k g·d）5 8 7±1 6.2*△

表7 小鼠血清中IL-1β質量濃度的比較（±SD，n=10）Table 7 The content of IL-1β in the serum of mice

表7 小鼠血清中IL-1β質量濃度的比較（±SD，n=10）Table 7 The content of IL-1β in the serum of mice

組別鼠數/只空白組1 0 2 0 m L/（k g·d）1 0 1 9.2±0.5 3△模型組他汀組I L-1 β 質量濃度/（p g/m L）劑量2 0 m L/（k g·d）1 0 1 8.5±0.7△1 0 m g/（k g·d）高劑量組1 0 2.1 6 g/（k g·d）1 8.4±1.2△中劑量1 0 1 8.5±0.8 4△1.4 4 g/（k g·d）1 0低劑量0.7 2 g/（k g·d）2 2.2±1.5 4●1 9.0±0.6 8△

3 討 論

病理學HE染色結果顯示，除空白組之外，其他各組均有不同程度的AS，其中以模型組最為嚴重，模型組主要表現為動脈內膜及瓣膜明顯增厚，斑塊內膽固醇結晶豐富，血管管腔嚴重狹窄，提示模型制備成功。阿托伐他汀和黑茶不同劑量組小鼠動脈斑塊明顯低于模型組，說明阿托伐他汀和黑茶對AS的發生發展均有抑制作用。從鏡下觀的成分來看，模型組、阿托伐他汀組、黑茶低劑量組主要成分為膽固醇結晶和泡沫細胞為主，而黑茶高、中劑量組主要成分以泡沫細胞為主。AS按照病理學分為脂紋脂斑期（泡沫細胞為主）、纖維斑塊期（纖維帽、脂類成分、泡沫細胞為主）、粥樣斑塊期（纖維帽、膽固醇結晶和泡沫細胞為主）以及繼發性病變。那么可見模型組、阿托伐他汀組、黑茶低劑量組已經發展為AS的中晚期，而黑茶高、中劑量組小鼠為AS的早期，由此得知安化黑茶高、中劑量用藥治療可以延緩AS的發生發展。

過度肥胖引起脂肪組織中的巨噬細胞比例增多，而且炎癥表型發生變化，浸潤性增強，巨噬細胞與脂肪組織中的脂肪細胞交互作用，加速了AS的發展進程[22]，為此抑制肥胖可以起到延緩AS發展的效果。實驗結果顯示安化黑茶不同劑量組小鼠肝臟重量和肝指數顯著低于模型組及阿托伐他汀組，提示安化黑茶可以起到很好的抑制體質量增長和減少腹部脂肪組織合成的效果；還可以減少脂類物質在肝臟的沉積。這可能是安化黑茶延緩AS發展的原因之一。

高脂血癥是引起AS發生的最主要的危險因素，從血脂四項檢測結果來看，安化黑茶可以有效降低TG含量，但是對于TC、LDL、HDL方面并沒有明顯的改善，可見安化黑茶在降低TG方面有明顯的優勢，并且效果優于阿托伐他汀。過多的脂類物質在動脈管壁的長期沉積加速AS的發生發展，而黑茶不同劑量組均可以通過抑制TG的合成來延緩AS的發生發展，這可能是黑茶延緩AS發展的原因之一。而阿托伐他汀在降低TG含量上具有明顯的優勢。為此推薦高脂血癥患者在日常生活中可以適當飲用黑茶來抑制甘油三酯的產生。而對于混合性高脂血癥等癥患者我們建議在服用他汀類藥物降低膽固醇的同時，可以配合常規攝入黑茶的方式來降低體內的甘油三酯的含量，從而抑制脂類物質在動脈管壁的沉積來延緩AS的發生發展。

OX-LDL主要是由于體內的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）生成增多并且發生氧化修飾所產生的，OX-LDL具有細胞毒性，可以通過多種途徑造成內皮細胞的損傷，并且對于血液中的單核細胞具有很強的趨化作用，從而促進泡沫細胞的形成和中膜平滑肌的遷移，是診斷AS的最佳指標[23-25]，故降低血液循環中的OX-LDL水平是預防AS形成的重要途徑。在內皮損傷的過程中，巨噬細胞釋放出IL-1β、TNF-α、MCP-1等炎癥因子， 炎癥反應過程中促使肝細胞產生大量的hs-CRP急性時相反應物，為此，作者通過檢測血清中OX-LDL、IL-β、TNF-α、MCP-1、hs-CRP 5個指標來進一步探索安化黑茶對于AS的干預機制。

“氧化應激學說”是比較公認的引起AS的學說之一，本次實驗顯示阿托伐他汀和黑茶不同劑量中OX-LDL含量明顯低于模型組，說明阿托伐他汀和黑茶用藥治療均可以起到抗氧化的作用，從而減少了LDL的氧化修飾對于機體所造成的損傷。

AS屬于慢性炎性疾病，炎癥反應伴隨著AS發生發展的始終，抗炎治療被認為是治療AS的有效措施。MCP-1作為作用很強的單核細胞趨化因子，具有調節單核細胞粘附和進入動脈管壁的雙重功能，其在單核細胞進入動脈內膜的過程中發揮著重要的作用，在AS發生的后期，對于促進斑塊的不穩定性也起著重要的作用[26]。阿托伐他汀和黑茶不同劑量組均可以有效抑制MCP-1的產生，從而起到了抑制泡沫細胞合成分泌的作用，延緩了AS的發生發展。

TNF-α是一種具有介導免疫反應和炎癥反應的重要的前炎癥因子，可以刺激白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1），白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和細胞粘附分子的表達，參與炎癥反應的級聯過程中，從而發揮促炎作用，其容易聚集到內皮細胞處造成內皮的損傷，為AS的形成創造條件[27-28]。從實驗數據來看，阿托伐他汀和黑茶不同劑量組灌胃用藥均可以通過抑制TNF-α的產生來達到抗炎的作用。

hs-CRP作為一種重要的炎性反應標志物，其水平的變化可直接反映AS斑塊的炎性反應程度[29]。臨床諸多實驗驗證C反應蛋白與AS的發生密切相關，是引發心血管疾病的獨立危險因素[30]。有研究證實hs-CRP可以起到調節單核細胞的作用，可激活補體和刺激組織因子的產生，從而導致血管內膜的損傷，使得脂類物質易于在血管內皮聚集，為AS的產生創造了條件[31]。本實驗可觀察到安化黑茶高、中劑量用藥可以有效的抑制hs-CRP的分泌，那么我們推測安化黑茶可以減少補體的產生，從而抑制炎癥反應對血管內皮細胞的損害，防止脂類物質在內皮表面的附著。

IL-1β作為白介素中重要的基因編碼，主要起著促炎作用，動物實驗已經驗證拮抗IL-1β信號通路可以起到很好的抑制AS發生的作用[32]。本實驗結果顯示阿托伐他汀和黑茶不同劑量組小鼠血清中IL-1β的含量有所下降，那么既然IL-1β作為重要的促炎因子，它的減少便可以有效的抑制TNF-α、hs-CRP等諸多因子的產生，可以說抑制IL-1β的產生對于抑制整個炎癥反應其中至關重要的作用。由此可見黑茶和阿托伐他汀均可以通過拮抗IL-1β信號通路而起到抗炎的作用。

從以上數據分析，安化黑茶延緩AS的發生可能與以下因素有關：1）安化黑茶通過抑制脂類物質在肝臟和動脈管壁的沉積來延緩AS的發展；2）安化黑茶可以通過抑制 IL-1β、TNF-α、hs-CRP等重要的促炎因子從而達到抑制炎癥反應的作用；3）安化黑茶可以通過抑制MCP-1和OX-LDL等重要的單核細胞趨化因子來防止過多的泡沫細胞在內皮細胞表面的沉積；4.安化黑茶具有抗氧化作用，可以減少LDL的氧化修飾，從而有效的抑制泡沫細胞的形成和減緩內皮細胞的損傷。

但是AS的發病機制尚不清楚，作者只是通過其降脂、抗炎、抗氧化、保護血管內皮細胞方面來分析其抗AS的可能機制。在后期的實驗過程中，我們會從其他方面來進一步的驗證，以期全方位、多角度的進一步分析其抗AS發生發展的機制。