通過計算方法預測甜菊糖苷的甜味和苦味

李 偉 ， 王海軍 ， 夏詠梅 *

（1．食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2．江南大學 化學與材料工程學院，江蘇 無錫214122）

甜菊糖苷（steviol glycoside），是甜葉菊的葉子中所含的二萜糖苷類物質。該類物質具有相同的骨架和不同的位于C-13和C-19位上的糖基，結構如圖1所示。與傳統的蔗糖和人造甜味劑不同，甜菊糖苷對人體更加安全，對人體健康的副作用更小[1]。甜菊葉中含有質量分數6%～10%的斯替夫苷（Stevioside），2%～4%的萊鮑迪苷 A（Rebaudioside A）和1%～2%的其他次要糖苷，它們具有各自獨特的結構和風味，一些主要的天然甜菊糖苷的結構和甜度如表1所示。其中，Rebaudioside A的甜度約為蔗糖的350倍，味感也最相近于蔗糖，有較高的應用價值。Stevioside在C-13位置上比Rebaudioside A少一個葡萄糖殘基，甜度為蔗糖的約250倍，雖然含量更高，但更強的后苦味降低了它的應用價值[2]。Rebaudioside D在C-19位上比Rebaudioside A多一個葡萄糖殘基，甜度雖降至約250倍蔗糖，但后苦味也更弱，因此綜合味感更好。由此可見甜菊糖苷上的糖基對其風味的重要影響[3]。目前已發現64種甜菊糖苷，但大部分由于含量較低，缺乏相關甜味數據。此外為了改善甜菊糖苷的風味，研究人員使用了許多生物或化學方法來修飾其結構[4-7]，但產品中多種物質混雜，難以徹底分離以驗證不同組分的甜度[8]。因此，如果能夠建立一種準確且省時省力的方法來預測甜菊糖苷的甜味和苦味，那么將有助于指導新型甜菊糖苷的設計和改性，從而獲得更優質的甜味劑。

圖1 甜菊糖苷分子結構式Fig.1 Molecule structure of steviol glycosides

表1 幾種天然甜菊糖苷的結構及甜度Table 1 Structure and sweetness of several natural steviol glycosides

在人體感知味覺的過程中，味覺受體起著關鍵作用。人體甜味受體 （human sweet taste receptor，hSTR）是由兩個亞基hT1R2和hT1R3組成的異二聚體蛋白，屬于C類G蛋白偶聯受體（C-GPCR）家族[11]。hT1R2和hT1R3結構包括氨基末端結構域（ATD）、半胱氨酸富集結構域（CRD）和7個跨膜螺旋結構域（TMD）[12]，其ATD部分由兩片以大間隙分隔的葉片構成，是與甜味劑發生結合的主要活性部位[13]。如糖（葡萄糖，蔗糖等）、二肽甜味劑（阿斯巴甜，阿力甜等）、甜蛋白（Thaumatin，Monellin 等）等物質都可以在該部分與甜味受體發生結合[14-15]。而人體苦味受體（human bitter taste receptor，hBTR）同樣屬于G蛋白偶聯受體，人體中苦味的感知主要依賴hTAS2R家族中的25種受體[16]，其中hTAS2R4（hT2R4）被發現在甜菊糖苷的苦味感知中起主要作用[17]。這些味覺受體通過不同的結合方式，與外來分子結合并被激活，引起一系列信號傳導反應，如G蛋白的激活，細胞內鈣釋放，細胞去極化和激活突觸等。最終產生特征性的味覺信號傳遞至大腦并引起人體對味覺的感知[18]。

作者通過計算方法，模擬味覺受體與甜菊糖苷之間的結合，從而預測甜菊糖苷的風味。目前，味覺受體的晶體結構尚未被解析，因此我們首先通過同源建模，建立了有高可信度的甜味受體hT1R2，hT1R3和苦味受體hT2R4的三維結構模型。接下來將天然甜菊糖苷作為配體，與味覺受體間進行分子對接，尋找計算結果與其甜味和苦味之間的關系，建立起用于預測甜菊糖苷風味的計算方法，并分析了甜菊糖苷結構的變化對其風味的影響。最后，通過這種方法，根據改性甜菊糖苷的結構預測其甜味和苦味，并挑選出可能的優質甜味劑。本研究有助于人們理解甜菊糖苷的結構與其風味之間的關系，明確設計或改性新型甜菊糖苷的思路，從而事半功倍地獲取新型甜味劑，擴展甜菊糖苷在食品藥物等領域中的應用。

1 材料與方法

1.1 使用軟件

Discovery Studio 2.5：美國BIOVIA公司產品；Chemdraw 15：美國CambridgeSoft公司產品。

1.2 計算與實驗方法

1.2.1 配體的準備 通過Chemdraw 15繪制一系列甜菊糖苷的分子結構（見表1和表4），并導入至Discovery Studio 2.5軟件中，通過Prepare Ligands工具進行對配體的預處理，改變離子化狀態，優化其構型。產生配體的3D模型，用于后續分子對接計算。

1.2.2 甜味受體的同源建模 在NCBI數據庫中檢索目標甜味受體hT1R2和hT1R3的氨基酸序列（ID：NP_689418.2，NP_689414.1）[19]。 并 對 其 進 行BLAST搜索，在PDB蛋白質數據庫中搜索對目標序列有較高一致性的模板蛋白。在Discovery Studio 2.5中導入目標和模板序列，生成目標-模板序列比對結果。隨后使用Build Homology Model工具，根據比對結果構建hT1R2和hT1R3的同源模型。通過Prepare Protein工具對受體模型進行優化，施加CHARMm力場并使其能量最小化。使用Ramachandran圖和Verify 3D分數評估模型的可靠性。

1.2.3 苦味受體的同源建模 對苦味受體hT2R4同樣進行上文中的檢索，結果發現與hT2R4間序列一致性最高的模板也僅有14%的序列一致性，這不足以生成有高可靠性的同源模型。作者使用ITASSER在線建模服務器[20]來進行建模工作。在提交hT2R4的氨基酸序列（Q9NYW5.1）后，I-TASSER從PDB數據庫中搜索具有一定相似性的模板，并從中切割出有較高相似性的片段，然后通過蒙特卡洛模擬對這些片段進行結構預測并組裝成完整蛋白模型。之后通過將模型調整到低自由能狀態，消除空間碰撞，優化氫鍵網絡等處理，確定最終生成的同源模型[21]。通過I-TASSER的TM-score，以及Ramachandran圖對模型的可靠性進行了檢測。

1.2.4 分子對接 使用Discovery Studio 2.5中的Define and Edit Binding Site工具對受體模型進行處理，篩選出可能存在的結合位點，并生成活性域以定義可能發生分子對接的區域。選擇CDOCKER半柔性對接方法對甜菊糖苷配體與味覺受體間進行分子對接計算，這種對接方法將大分子受體模型固定，而允許小分子配體模型的構象在合理范圍內發生改變，在保證計算準確性的同時減少了計算量[22]。CDOCKER方法計算了配體-受體間相互作用能，根據能量篩選結合位置以確定最終的對接構象，對接過程中相互作用能的值越高，受體和配體之間的結合越穩定[23]。

2 結果與討論

2.1 甜味受體的同源建模

通過BLAST搜索來尋找與甜味受體hT1R2和hT1R3間有較高相似性的模板。該方法基于模板與目標序列間的序列一致性和E值來進行選擇，序列一致性越高且E值越低，模板與目標序列間相似性越高，更適合用于同源建模[19]。搜索結果顯示青鳉魚味覺受體T1R2-T1R3配體結合域晶體結構的B鏈（PDB ID：5X2M_B）與 hT1R2和 hT1R3受體間最為相似。與此前研究者們用于甜味受體同源建模的模板 3LMK_A[19]、2E4U_A[24]、1EWK_A[25]相 比 ， 它 與hT1R2和hT1R3間有最高的序列一致性和最低的E值，如表2所示。因此，選用5X2M_B作為構建甜味受體同源模型的理想模板。

表2 用于甜味受體同源建模的不同模板的比較Table 2 Comparison of different templates used for homology modeling of sweet taste receptors

使用Discovery Studio 2.5的Build Homology Model工具構建同源模型（圖2（a））。可見所建模型對應于甜味受體的ATD部分，主要由兩個大葉片構成，中間存在較大空隙（圖中亮綠色部分），這里也是甜味受體與配體間主要發生結合的位點所在[26]。Ramachandran 圖（圖 2（a））表明，對 hT1R2 而言，96.5%的氨基酸殘基處于合理區域 （藍線范圍內綠點），2.0%處于允許區域（藍線到粉線范圍間綠點），1.5%處于異常區域 （粉線外紅點）。而對hT1R3而言，這個比例則是94.5%、3.3%、2.2%。在此前的研究中，所構建的甜味受體同源模型中最多也只有90%的氨基酸殘基處于合理區域[19，24]。Verify 3D分數對模型結構的可靠性進行了打分（圖2（b），藍色部分為高分區，可靠性高；紅色部分為低分區，可靠性低），對 hT1R2為 0.65，對 hT1R3為 0.95，該值越接近1，模型質量越好。在此前的研究中，甜味受體的Verify 3D分數處于0.4至0.8的范圍內[27]。以上分析證明，hT1R2和hT1R3甜味受體模型的絕大部分氨基酸殘基都處于合理構象，模型的評價結果較好，可靠性較高，可用于后續分子對接計算。

圖2 同源模型結構Fig.2 Homology models

2.2 苦味受體的同源建模

對于苦味受體hT2R4，I-TASSER建模服務器共 選 擇 了 8 個 模 板 （4GRV，5TJV，4N6H，5ZBH，5G1H，4DJH，4BUO和5HAS），它們與目標序列的一致性在9%～13%之間。雖然這些模板的整體相似性較低，但I-TASSER切割出模板中與目標序列有較高相似性的片段并對其進行結構預測，然后組裝成完整的苦味受體模型，從而保證模型整體的可靠性[21]。

如圖2（c）所示，hT2R4同源模型由多根氨基酸螺旋構成，結合位點位于螺旋中央的空隙處。ITASSER使用TM-Score來評價建模質量，TMScore＞0.5則代表模型與天然蛋白質結構較為相似[20]。最終得到的hT2R4同源模型的TM-Score為0.70±0.12，處于較高水平，證明建模結果具有較高的可信度。此外，hT2R4的Ramachandran圖 （圖2（c））顯示，有93.0%的氨基酸殘基處于合理區域，5.3%處于允許區域，1.7%處于異常區域，這也與過去研究的結果相似[28]，證明大部分氨基酸殘基都處于合理構象，模型可靠性較高。

2.3 天然甜菊糖苷分子對接計算結果

將上述同源模型用于與天然甜菊糖苷之間的分子對接計算，以探究計算結果與甜菊糖苷的甜味和苦味之間的關系。在此前的研究中，人們發現甜菊糖苷與甜味受體hT1R2和hT1R3之間的相互作用能（Interaction Energy，IE）與其甜度密切相關[29]，hT1R2和hT1R3能夠分別觸發彼此獨立的甜味信號，由兩個亞基的累積效應引起甜味感知，因此可以通過將hT1R2和hT1R3與某種甜菊糖苷間的相互作用能（IEhT1R2，IEhT1R3）相加，以得到該甜菊糖苷與甜味受體間的總相互作用能（IEs）[19]；同時用hT2R4與甜菊糖苷間的相互作用能（IEhT2R4）來代表甜菊糖苷與苦味受體間的總相互作用能（IEb）[28]。計算結果如表3所示，發現甜菊糖苷的IEs與其甜度之間存在明顯的正相關趨勢，兩者的大小排序大致相同，高甜度的甜菊糖苷通常具有較高的IEs。對苦味受體也有同樣的結論，Rubusoside和Stevioside等具有較強苦味的甜菊糖苷，其IEb都超過了45 kJ/mol。而苦味較弱的甜菊糖苷（Rebaudioside A、D、M）的IEb都低于40 kJ/mol。

結果表明，甜菊糖苷與味覺受體間的相互作用能可以在一定程度上反映其引發的相應味覺的強弱。因此，可通過計算找到與甜味受體間相互作用能（IEs）較高而與苦味受體間相互作用能（IEb）較低的甜菊糖苷，其最有可能使人感受到更強的甜味和更弱的苦味，從而產生較好的風味。

表3 天然甜菊糖苷與hT1R2，hT1R3和hT2R4間的相互作用能和產生相互作用的氨基酸殘基Table 3 Interaction energy （IE） and residues involved in protein–ligand interactions of hT1R2，hT1R3 and hT2R4 with natural steviol glycosides

2.4 甜菊糖苷結構的改變對其風味的影響

分析上述對接結果可以發現，在甜菊糖苷的C-13和C-19位上僅有葡萄糖基的情況下，其與味覺受體間的相互作用能和其葡萄糖基數量間存在著一定的變化規律。當C-19位上糖基保持不變時，隨著C-13位上葡萄糖基數量的增加 （Rubusoside＜Stevioside＜Rebaudioside A），甜菊糖苷與甜味受體間相互作用能（IEs）升高，與苦味受體間相互作用能（IEb）下降。而當C-13位上糖基不變時，隨著C-19位上葡萄糖基數量增加 （Rebaudioside A＜Rebaudioside D＜Rebaudioside M），甜菊糖苷的IEs和IEb都在降低。即C-13位上葡萄糖基數量的增加導致甜菊糖苷的甜味增強，苦味減弱，C-19位上葡萄糖基數量的增加導致甜味和苦味都減弱。

通過分析甜菊糖苷與味覺受體之間的相互作用模式可以解釋上述現象。甜菊糖苷 （圖3，以Rebaudioside A為例）與味覺受體間的主要相互作用為受體的氨基酸殘基與甜菊糖苷葡萄糖基上羥基之間的氫鍵作用。而C-13和C-19位上葡萄糖基數量的改變對甜菊糖苷風味造成的不同影響，可能是由于甜味和苦味受體的結合位點的空間差異所引起的。一方面，甜味受體的結合位點（圖2（a），亮綠色部分）位于氨基末端結構域的兩個葉片之間的大間隙中，具有較大的空間，配體進入結合位點時所受空間限制較小。另一方面，苦味受體的結合位點（圖2（c），亮綠色部分）位于數根氨基酸螺旋之間的空隙中，空間較小，配體進入結合位點時所受空間限制較大。因此甜菊糖苷從體積較大的C-13糖基一側進入甜味受體位點，從體積較小的C-19糖基一側進入苦味受體位點。Rubusoside、Rebaudioside A、Rebaudioside M與味覺受體間的對接構象（圖4）也證明了這一點。

圖3 Rebaudioside A（RA）與 hT1R2，hT1R3和 hT2R4間相互作用模式圖Fig.3 Interaction patterns of Rebaudioside A （RA）with hT1R2，hT1R3 and hT2R4

所以當C-13位上葡萄糖基數量增加時 （圖4，從Rubusoside到Rebaudioside A），甜菊糖苷依然可以從該側較輕松地進入空間較大的甜味受體的結合位點中。更多的糖基有利于與氨基酸殘基間產生更強的相互作用和更高的IEs，從而激發更強烈的甜味信號。而在與苦味受體結合時，由于位點的空間較小，只有C-19位上的糖基能夠進入位點，C-13位上較大的糖基不但由于距離較遠難以與氨基酸殘基間產生相互作用，并且會影響苦味受體與甜菊糖苷間結合構象的穩定性，使其IEb下降，導致苦味減弱。而當C-19位上葡萄糖基數量增加時（圖4，從Rebaudioside A到Rebaudioside M），甜菊糖苷仍舊從C-13位方向與甜味受體結合，C-19位上的糖基在另一側難以進入位點，僅會影響結合構象的穩定性。在與苦味受體結合時，C-19位上的糖基由于體積增大，也無法深入空間較小的結合位點，使得甜菊糖苷與苦味受體間的結合穩定性變差，因此導致IEs與IEb都降低，表現出甜味與苦味都在減弱。

圖4 Rubusoside （Ru），Rebaudioside A （RA），Rebaudioside M（RM）與 hT1R2，hT1R3，hT2R4 間的對接構象Fig.4 Docking poses of Rubusoside（Ru），Rebaudioside A（RA） and Rebaudioside M （RM） docked on hT1R2，hT1R3 and hT2R4

2.5 預測改性甜菊糖苷的風味

根據以上的分析，作者預測在C-13位上有較多葡萄糖基的甜菊糖苷可能具有較強的甜味和較弱的苦味，能夠成為優質甜味劑。在此前的研究中，許多研究者通過生物或化學改性方法，對甜菊中含量最高的Stevioside或Rebaudioside A進行改性，在C-13位上增加葡萄糖基從而得到新型甜菊糖苷。但是由于產品組分混雜，分離困難，難以驗證其風味。因此我們在此選擇了8種改性甜菊糖苷，其結構如表4所示[30-33]。通過計算方法來預測其風味，計算結果如表5所示。

分析以上計算結果可以發現，相比C-13位上有 3 個葡萄糖基（編號 1、2、3、4），有 4 個葡萄糖基（編號 5、6、7、8） 的改性甜菊糖苷通常具有更高的IEs和更低的IEb，即甜味更強且苦味更弱，這與之前分析天然甜菊糖苷計算結果得出的結論相符。相比天然甜菊糖苷中有最高甜度與應用價值的Rebaudioside A，在這8種改性甜菊糖苷中，編號5、6、8預測有更強的甜味和更弱的苦味，其中6號被預測為甜味最強而苦味最弱，可能有作為優質甜味劑投入應用的潛力。

表4 改性甜菊糖苷的結構Table 4 Structures of modified steviol glycosides

表5 改性甜菊糖苷與hT1R2，hT1R3和hT2R4間的相互作用能和產生相互作用的氨基酸殘基Table 5 Interaction energy （IE） and residues involved in protein–ligand interactions of hT1R2，hT1R3 and hT2R4 with modified steviol glycosides

不同的甜菊糖苷與味覺受體結合時，都有各自獨特的相互作用模式，能夠與味覺受體的不同組合氨基酸殘基間產生相互作用。分析表3和表5可知，分別有24、21和17個氨基酸殘基參與了甜菊糖苷與hT1R2、hT1R3和hT2R4間產生氫鍵的相互作 用 中 。 其 中 ，Ser290 （hT1R2），Glu131，Glu284（hT1R3）和 Ser263（hT2R4）可分別與 11，7，6 種甜菊糖苷間產生氫鍵，是與甜菊糖苷間產生氫鍵最頻繁的氨基酸殘基，在甜味和苦味的感知過程中起到重要作用。與其他甜菊糖苷相比，每種甜菊糖苷都具有各自獨特的風味，這是由于甜菊糖苷的C-13和C-19位上具有不同結構的糖基。這些糖基與味覺受體中的眾多氨基酸殘基以不同組合的方式發生相互作用，并激發有各自特征性的味覺信號，信號傳遞到大腦最終使人感受到不同的風味。

3 結語

通過合適的模板，構建起具有高可靠性的甜味（hT1R2，hT1R3）和苦味（hT2R4）受體的同源模型，并與一系列甜菊糖苷之間進行分子對接研究。發現計算得到的受體-配體間相互作用能與甜菊糖苷的風味高度相關，與甜味受體間有高相互作用能且與苦味受體間有低相互作用能的甜菊糖苷最有可能具有較強的甜味和較弱的苦味。通過該方法，還預測了改性甜菊糖苷的風味并篩選出可能的優質甜味劑。通過分析計算結果和相互作用模式，我們發現C-13位上葡萄糖基的增多會導致甜菊糖苷的甜味增強而苦味減弱，C-19位上葡萄糖基的增多會導致甜味和苦味都減弱。這些不同的變化趨勢是由甜味和苦味受體間的結構不同所引起的。甜菊糖苷通過C-13和C-19位上的糖基，與味覺受體中不同組合的氨基酸殘基間發生相互作用，從而激發特征性的味覺信號并使人感知到不同的風味。通過這種計算方法，可以更好的理解甜菊糖苷的結構與其風味之間的聯系，預測具有新設計結構的甜菊糖苷的風味，從而判斷它是否是合適的甜味劑。這為進一步通過生物或化學改性方法改善甜菊糖苷的風味指明了方向，為新型甜味劑的預測和設計提供了新的途徑。