分散固相萃取結合液相色譜-串聯質譜法測定水產品中11 種四環素類藥物

黃鸞玉 吳祥慶 陳秀荔 趙永貞 龐燕飛

摘 要：采用分散固相萃取結合液相色譜-串聯質譜儀，建立水產品中11 種四環素類藥物殘留的分析方法。樣品經Na2EDTA-McIIvaine緩沖溶液分散后，以體積分數1%乙酸乙腈提取，提取液經鹽析及脫水后取乙腈層，用C18凈化。目標物用C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 ?m）分離，以甲醇和體積分數0.1%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，利用電噴霧離子源多反應監測模式進行檢測。結果表明：11 種化合物在各自的質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.998;大多數化合物在定量限添加水平下的響應良好，在2 倍和5 倍定量限添加水平下平均回收率普遍大于80%，相對標準偏差為3.2%～10.3%（n=6）;檢出限（RS/N=3）和定量限（RS/N=10）分別為2.9～6.1 ?g/kg和10～20 ?g/kg。該方法簡便、快速、靈敏，適用于水產品中11 種四環素殘留物的定性、定量分析。

關鍵詞：水產品;液相色譜-串聯質譜法;分散固相萃取;四環素類;獸藥殘留

Determination of 11 Tetracycline Residues in Aquatic Products Using Dispersive Solid Phase Extraction-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

HUANG Luanyu， WU Xiangqing， CHEN Xiuli， ZHAO Yongzhen， PANG Yanfei

（Guangxi Academy of Fishery Sciences， Nanning 530021， China）

Abstract： An analytical method using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with a dispersive solid phase extraction （DSPE）procedure for sample preparation was developed to determine 11 tetracycline residues in aquatic products. The samples were dispersed in Na2EDTA-McIIvaine buffer solution and extracted with acetonitrile containing 1% （V/V） acetic acid. After that， the extract was salted out and dehydrated by adding anhydrous sodium sulfate， and the acetonitrile phase was harvested and purified using a C18 sorbent. The analytes were separated on a C18 column （100 mm × 2.1 mm， 3 ?m） with gradient elution using a mobile phase containing methanol and 0.1% （V/V） formic acid aqueous solution. Mass spectrometry was performed using an electrospray ionization source in the multiple reaction monitoring （MRM） mode. The correlation coefficients of the standard calibration curves for the 11 tetracyclines were all above 0.998. Most of the compounds showed good response at the limit of quantitation （LOQ） level. The average recoveries of most compounds were more than 80% at spiked concentrations two- and five-fold higher than the LOQ， with relative standard deviations of 3.2%–10.3% （n = 6）. The limits of detection （LODs， RS/N = 3） and LOQs （RS/N = 10） were

2.9–6.1 and 10–20 ?g/kg， respectively. The method is simple， rapid， sensitive， and suitable for the simultaneous determination of the 11 tetracycline residues in aquatic products.

Keywords： aquatic products; liquid chromatography tandem mass spectrometry; dispersive solid phase extraction; tetracyclines; veterinary drug residues

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201123-274

中圖分類號：O657.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）12-0061-07

引文格式：

黃鸞玉， 吳祥慶， 陳秀荔， 等. 分散固相萃取結合液相色譜-串聯質譜法測定水產品中11 種四環素類藥物[J]. 肉類研究， 2020， 34（12）： 61-67. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201123-274.? ? http：//www.rlyj.net.cn

HUANG Luanyu， WU Xiangqing， CHEN Xiuli， et al. Determination of 11 tetracycline residues in aquatic products using dispersive solid phase extraction-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2020， 34（12）： 61-67. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20201123-274.? ? http：//www.rlyj.net.cn

四環素類（tetracyclines，TCs）藥物是水產養殖業中常用的獸藥和飼料添加劑，起到預防和治療各類細菌性疾病的作用。綜合分析中國和歐美等主要水產品生產國的用藥情況可知，由于在養殖過程中長期大量使用，不遵守休藥期，容易導致該類藥物在機體中殘留，危害人類身體健康，另一方面極易導致耐藥菌株逐年增加，不僅降低藥物療效，也限制了其他抗生素的使用[1-2]。因此，國內外對TCs藥物的使用采取了嚴格的監控，中國和歐美等多個國家已相繼制定肉制品中TCs藥物的最大殘留限量（maximum residue limit，MRL）為100 ?g/kg，國際食品法典委員會和日本規定MRL為200 ?g/kg[3]。受監控的藥物多以土霉素（oxytetracycline，OTC）、四環素（tetracycline，TC）、金霉素（chlortetracycline，CTC）和多西環素（doxycycline，DC）為主，在實際應用中，為避免耐藥性、提高療效和逃避監管，使用地美環素（demeclocycline，DMC）、美他環素（methacycline，MTC）、米諾環素（minocycline，MNC）和甲氯環素（meclocycline，MCC）等新型TCs藥物替代被限量監管的藥物用于水產、畜牧生產的潛在風險不斷加大。此外，TCs藥物不穩定，容易轉變為藥效極低、毒性更強的差向異構體[4-5]。因此，對新型TCs藥物及代謝物

4-差向土霉素（4-epi oxytetracycline，EOTC）、4-差向四環素（4-epi tetracycline，ETC）和4-差向金霉素（4-epi chlortetracycline，ECTC）進行檢測非常必要。

目前，TCs藥物殘留量的檢測方法主要有薄層色譜法[6-8]、酶聯免疫法[9-11]、微生物法[12-14]、電化學分析

法[15-16]、液相色譜法[17-19]和液相色譜-串聯質譜法[20-22]等。薄層色譜法和酶聯免疫法的優點是簡單、快捷和不需要復雜儀器等，缺點是分辨率和靈敏度均不高，易出現假陽性，不可作為殘留確證方法;微生物法耗時較長，易受其他抗生素干擾，專一性和精確度不高;液相色譜法是目前研究TCs藥物殘留最常用的檢測方法[23-25]，具有分析速度快和適用范圍廣等特點[26-28]，但前處理比較復雜，分析時間長，易造成待檢藥物損失，上機分析易受基質干擾的影響[29-30]。液相色譜-串聯質譜法能有效減少基質干擾，靈敏度更高，結果精確可靠[31]，是TCs藥物殘留檢測的首選方法。但到目前為止，同時檢測水產品中新型TCs藥物、常規TCs藥物及其代謝物的相關報道還很少。

本研究選擇水產品肌肉組織為分析對象，通過優化色譜流動相組成和洗脫程序，得到較好的色譜峰型;通過優化提取和凈化條件，提高方法的適用性、回收率和檢測效率;建立靈敏度高、專屬性強的同時檢測TCs藥物及其代謝物的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水產品樣品由養殖場抽取，樣品數分別為對蝦10 個、大黃魚12 個、鯉魚10 個、鱸魚12 個、大菱鲆10 個、烏鱧10 個、梭子蟹10 個、扇貝10 個;空白水產品樣品（質控樣品）為未檢出目標化合物的鯉魚樣品。

OTC（純度97%）、TC（純度95%）、CTC（純度96%）、DC（純度98%）、DMC（純度92.8%）和MTC（純度97.9%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司;EOTC（純度95%）、ETC（純度93.8%）、ECTC（純度>90%）、MNC（純度97%）和MCC（純度97%） 加拿大TRC公司。

十八烷基硅烷（octadecyl silane，C18）、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、氨基吸附劑（amino adsorbent，NH2）、石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB） 美國Agilent公司;甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Tedia公司;NH4OAc（色譜純）、Na2EDTA·2H2O、NaCl、NaOAc、MgSO4、Na2SO4、Na2HPO4·12H2O、C6H8O7·H2O（均為分析純） 上海安譜科學儀器有限公司。

1.2 儀器與設備

TSQ Fortis三重四極桿質譜聯用儀（配UltiMate 3000液相色譜系統） 美國Thermo公司;ZWF-334往復式振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;TDZ5-WS多管架自動平衡離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;EOFO-945066數顯型多管式漩渦混合器 美國Talboys公司;Syncore Polyvap平行蒸發儀 瑞士Buchi公司;H35循環水冷卻器 萊伯泰科有限公司;Synergy UV超純水系統、XS205DU電子天平 美國Mettler公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

分別稱取各標準品適量，用甲醇溶解并定容，配制成質量濃度為100 ?g/mL的單標儲備液，置于棕色螺口樣品瓶中，于-18 ℃冰箱中保存。分別取各標準儲備液400 ?L于同一容量瓶中，用甲醇定容至20 mL，配制成各化合物質量濃度為2 000 ?g/L的混合標準工作液，臨用時分別移取適量工作溶液，用0.1%甲酸水溶液-甲醇（8∶2，V/V）配制成各化合物質量濃度分別為2、5、10、25、50、100、200、400、800、1 200 ?g/L的標準溶液，用于繪制標準工作曲線。

0.1 mol/L Na2EDTA-McIIvaine緩沖溶液：準確稱取37.23 g Na2EDTA·2H2O、12.93 g C6H8O7·H2O和10.92 g Na2HPO4·12H2O溶解于0.9 L超純水，用HCl調節pH值至4.0，轉移至容量瓶，用超純水定容至1 L，混合均勻。

1.3.2 樣品處理

稱取（5.00±0.05） g均質后的樣品于50 mL離心管中，加入2 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-McIIvaine緩沖溶液，勻漿30 s，用15 mL體積分數1%乙酸-乙腈清洗刀頭，洗液并入樣品離心管中，加入0.5 g NaCl，渦旋振蕩1 min，再加入10 g無水Na2SO4（用前于650 ℃烘烤4 h），混勻，振蕩提取10 min，4 000 r/min離心5 min，將上清液轉移至另一干凈離心管中，向上清液中加入200 mg C18，振蕩凈化5 min，4 000 r/min離心5 min，上清液轉移至平行蒸發管中，45 ℃平行蒸發至干。用2 mL 0.1%甲酸水溶液-甲醇（8∶2，V/V）充分溶解殘渣，過0.22 ?m微孔濾膜，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.3.3 色譜條件

Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 ?m）;柱溫35 ℃;樣品室溫度21 ℃，進樣量10 ?L;流速0.3 mL/min;流動相A為水（含體積分數0.1%甲酸），流動相B為甲醇;梯度洗脫程序：0～2 min，90%流動相A;2～3 min，90%～78%流動相A;3～10 min，78%流動相A;10～11 min，78%～60%流動相A;11～13 min，60%～30%流動相A;13～15 min，30%流動相A;15～15.1 min，30%～5%流動相A;15.1～16 min，5%流動相A;16～16.1 min，5%～90%流動相A;16.1～18 min，90%流動相A。

1.3.4 質譜條件

離子源為電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI），正離子模式，多反應監測掃描;噴霧電壓3 500 V;離子傳輸管溫度350 ℃;蒸發溫度300 ℃;碰撞氣壓力1.5 mTorr（0.2 Pa）;鞘氣流速35 L/h;輔助氣流速10 L/h。11 種TCs獸藥的其他質譜參數見表1。

1.3.5 結果計算

樣品中TCs藥物的含量按下式計算。

式中：X為樣品中TCs藥物含量/（?g/kg）;ρ為樣品溶液中TCs藥物質量濃度/（?g/mL）;V為樣品溶液體積/mL;m為樣品質量/kg。

1.4 數據處理

用Xcalibur軟件進行色譜圖采集及數據處理，用Excel 2016軟件繪制柱狀圖。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的優化

2.1.1 流動相優化

本研究分別以乙腈和甲醇作為有機相，考察在水相中添加體積分數0.1%甲酸、5 mmol/L NH4OAc、5 mmol/L

NH4OAc（含體積分數0.1%甲酸）對色譜分離和質譜靈敏度的影響。結果表明：添加NH4OAc時11 種TCs化合物的色譜峰拖尾嚴重（圖1），這是由于NH4OAc不能完全阻斷TCs化合物與色譜柱硅羥基的相互作用;僅添加甲酸，各化合物離子化效率更高，拖尾現象明顯改善，靈敏度普遍較好;OTC和EOTC、TC和ETC、CTC和ECTC，這3 組差向異構體具有相同的準分子離子，

m/z分別為461.2、445.2、479.2，要通過保留時間差異來區分，有機相選用乙腈和甲醇，都能將CTC和ECTC分離，但是，OTC和EOTC、TC和ETC 2 組差向異構體在有機相為乙腈的條件下，色譜峰形展寬，無法實現基線分離，不能對其準確定量，選用甲醇作為流動相的有機相時，色譜峰形尖銳，分離度和重復性更好。因此，本研究最終采用0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動相。ESI+模式下各化合物的選擇離子色譜圖見圖2

2.1.2 質譜條件優化

配制質量濃度為1 ?g/mL的單標溶液，以流動注射的方式，在5 ?L/min流速下，用ESI源分別進行正離子和負離子全掃描，所有TCs化合物響應最佳的準分子離子峰均在正離子模式下獲得，均為[M+H]+;將其作為母離子進行二級質譜掃描，得到各化合物的碎片離子，根據歐盟決議有關質譜分析方法不得少于4 分的規定，選取豐度較強、信噪比較高的2 對子離子為特征離子，其中豐度相對較強的為定量離子，其次為定性離子;進一步優化碰撞能量和透鏡電壓。

設置六通閥，使初始色譜柱流出液切換至廢液，從4 min開始切換至質譜采集數據，15 min后結束采集，切出質譜儀，確保大部分極性較強和極性較弱的雜質在4 min之前和15 min之后被洗脫在質譜儀之外，減輕對質譜儀的污染。

2.2 樣品前處理條件的優化

2.2.1 提取劑的選擇

水產品樣品質地黏稠，絞碎后不容易分散，采用勻漿機分散樣品，易出現部分樣品附著在勻漿機搗桿上，造成待測化合物損失。本研究涉及的11 種TCs化合物易與多價陽離子形成不溶性螯合物。EDTA是一個具有六齒配體的良好配合劑，可競爭配合基質中存在的大多數多價陽離子，使TCs化合物游離出來。實驗發現，先加入Na2EDTA-McIIvaine緩沖溶液，既有利于分散樣品，增加有機提取劑與樣品的接觸面積，又能夠避免TCs化合物與多價陽離子發生反應。因此，在提取樣品時應預先加入少量Na2EDTA-McIIvaine緩沖溶液，再加入適量有機提取劑。

水產品肌肉組織的主要基質干擾物是脂肪、蛋白質和少量色素。TCs化合物極性較強，選擇極性溶劑作為提取劑，既可以保證提取效率，同時又盡可能地去除了基質中的干擾物。乙腈和甲醇均具有良好的沉淀蛋白質及提取TCs化合物的能力，然而用甲醇提取會帶入更多的極性基質干擾物，增加后續凈化難度，因此選擇乙腈作為提取溶劑。

TCs化合物具有共同的氫化駢四苯母核，是兩性物質，在堿性溶液中易降解，在酸性溶液中較穩定。乙腈中加入適量甲酸或乙酸，可維持TCs化合物的穩定性，但是隨著pH值的不同會發生差向異構化和降解等反應，當pH<2時易發生消去反應生成脫水物，因此，本研究選擇酸性相對較弱的乙酸。進一步對乙腈中乙酸的添加比例進行研究，發現體積分數1%乙酸乙腈的平均回收率高于2%乙酸乙腈與0.5%乙酸乙腈;1%乙酸乙腈pH值約4.0，而0.5%乙酸乙腈pH值約4.6，2%乙酸乙腈pH值約3.5，pH值太高或太低都會影響回收率。

本研究還比較了Na2EDTA-McIIvaine緩沖溶液與1%乙酸乙腈體積比分別為1∶15、2∶15、3∶15和4∶15時的提取效率，發現體積比為1∶15時，樣品分散效果不好，且不能完全阻止TCs化合物發生螯合反應，大多數化合物回收率不足80%，體積比為2∶15和3∶15時，樣品分散效果良好，CTC回收率分別為79.4%和77.1%，其余化合物回收率為80.5%～91.5%。隨著水相含量增加，后續脫水劑用量加大，體積比為4∶15時，無水Na2SO4用量將不少于20 g，回收率也明顯下降。因此，最終選擇2 mL Na2EDTA-McIIvaine緩沖溶液和15 mL 1%乙酸乙腈作為提取溶劑。不同體積比的提取溶劑對11 種TCs獸藥回收率的影響見圖3。

2.2.2 鹽析劑和脫水劑的選擇

乙腈與水互溶，蒸發濃縮難度大，因此在濃縮前應加入適量鹽，誘導乙腈產生相分離，促使水相中的TCs化合物在相分離過程中被萃取到乙腈相。由于多價陽離子與TCs化合物存在螯合反應，本研究避開多價陽離子鹽，選擇NaCl與NaOAc 2 種鈉鹽作為鹽析劑，考察二者添加量分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g時的鹽析效果。結果表明，向提取溶劑中加入0.5 g鈉鹽即可誘導兩相分離;NaCl作為鹽析劑，TCs化合物的平均回收率為80%，NaOAc作為鹽析劑會不同程度地降低TCs化合物的回收率，平均回收率降低至69%，這可能與NaOAc溶解后會改變溶液的pH值有關。進一步比較商用凈化包常用的脫水劑無水MgSO4和無水Na2SO4的影響，當選用無水MgSO4作為脫水劑時，平均回收率僅為23%，可能與TCs化合物易與Mg2+形成螯合物，發生沉淀有關;另一個原因是TCs化合物熱穩定性較差，無水MgSO4吸水瞬間釋放大量熱量，使溶液溫度升高，導致化合物結構發生變化，無水Na2SO4則沒有放熱現象，平均回收率明顯大于無水MgSO4。因此，無水Na2SO4更適合用作TCs殘留檢測的脫水劑。對比無水Na2SO4添加量為3、5、8、10、13 g的脫水效果，由于水產品本身含水量較高，當無水Na2SO4添加量小于8 g時，水層并未被完全吸收，添加量8 g基本將水層吸收，考慮到乙腈層中也含有少量水，添加10 g脫水劑，11 種TCs化合物的回收率良好。故本研究選用0.5 g NaCl作為鹽析劑，10 g無水Na2SO4作為脫水劑。

2.2.3 凈化吸附劑的選擇

樣品經過提取，已經去除了絕大部分干擾物，但仍可能存在少量脂肪和色素等雜質，為了進一步提高凈化效率，減少上機分析的基質效應，本研究采用分散固相萃取的凈化方式，比較C18、PSA、NH2和GCB 4 種吸附劑的凈化效果。前3 種均以硅膠為基質，分別鍵合C18、PSA和氨丙基。實驗結果表明，GCB脫色效果最好，同時也吸附待測化合物，導致TCs化合物基本無回收;NH2凈化樣品在最終復溶過微孔濾膜后依然渾濁，上機分析會堵塞管路，污染儀器;PSA和C18凈化效果良好，比較二者的回收率發現，使用PSA處理時的回收率僅為63%左右，使用C18處理時的回收率可提高到80%以上，原因是C18主要吸附油脂和弱極性、非極性物質，對待測化合物無明顯吸附。故選擇C18作為吸附劑。進一步比較C18用量為100、200、400、600 mg時對TCs化合物回收率的影響，結果表明，100 mg添加量的凈化效果不佳，過量使用會吸附部分待測化合物，導致回收率降低，當C18用量為200 mg時，可獲得滿意的凈化效果和回收率，見圖4。

2.3 方法學評價

2.3.1 線性關系、檢出限與定量限

按1.3.1節的方法配制10 個質量濃度水平的工作液進行標準工作曲線的制作。在選定的色譜條件和質譜參數下進行檢測，以目標化合物定量離子的峰面積（y）為縱坐標，質量濃度（x，μg/L）為橫坐標繪制工作曲線，得到線性回歸方程。

由表2可知，MNC、DMC、CTC和ECTC的線性范圍為10～800 ?g/L，其余化合物的線性范圍為

5～800 ?g/L，相關系數為0.998 6～0.999 7，表明各化合物在相應的質量濃度范圍內線性關系良好。以定量離子信噪比（RS/N）=3為樣品的檢出限（limits of detection，LOD），

RS/N=10為LOQ，11 種獸藥的LOD為2.9～6.1 ?g/kg，LOQ為10～20 ?g/kg，能夠滿足中國、日本、歐盟的食品安全標準要求。

2.3.2 回收率與精密度

在水產品空白樣品中添加11 種獸藥混合標準溶液，制備獸藥含量分別為1 倍、2 倍和5 倍LOQ水平的加標樣品，按上述前處理方法及測定條件進行回收率實驗，每個濃度水平做6 次平行測定，以標準曲線定量。由表2可知，在LOQ添加水平下各化合物的響應良好，在2 倍和5 倍LOQ添加水平下，平均回收率普遍大于80%，RSD為3.2%～10.3%，表明該方法有良好的重復性，符合多殘留分析的要求。

2.4 實際樣品測定

將本研究建立的方法應用于檢測水產品中TCs藥物的殘留量。采集養殖場的對蝦、大黃魚、鯉魚、鱸魚、大菱鲆、烏鱧、梭子蟹、扇貝養殖品種共84 個進行檢測，同時檢測質控樣品。檢測結果顯示，質控樣品回收率滿足分析要求;實際樣品中，2 份樣品中檢出MTC，殘留量分別為3.73、1.89 ?g/kg，1 份樣品檢出MCC，殘留量為2.06 ?g/kg，其含量均低于方法定量限，其他樣品均未檢出TCs獸藥。

3 結 論

本研究解決了新型TCs藥物、常規TCs藥物及其代謝物由于結構相似、易相互轉化導致的較難進行色譜分離、較難同時定性定量分析的難題，建立了水產品中11 種TCs藥物的分散固相萃取凈化-液相色譜-串聯質譜定量分析方法。分別對提取溶劑、鹽析劑、脫水劑、吸附劑的選擇與用量等樣品前處理條件、液相色譜條件和質譜條件進行優化，采用改進的分散固相萃取方法處理樣品，發揮其快速、簡便、高通量的優勢，與國標方法和現有文獻方法相比，該方法增加了待檢藥物的數量，縮短了檢測周期，節約了檢測成本。建立的方法操作簡便、快速、凈化效果好，靈敏度、準確度和精密度均符合多殘留檢測技術的要求，為各食品檢測機構提供了準確的定性和定量分析方法，有助于食品檢測機構應對大批量的水產品樣品TCs獸藥殘留的日常監控。

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