中性/聚電解質高分子混合刷對蛋白質的吸附/解吸附

趙新軍,李九智,馬 超

(1.伊犁師范大學 新疆凝聚態相變與微結構實驗室，伊寧 835000;2.伊犁師范大學 微納電傳感器技術與仿生器械實驗室，伊寧 835000;3.新疆維吾爾自治區人民醫院 泌尿外科，烏魯木齊 830000)

1 引 言

高分子混合刷(mixed polymer brushes)是由兩種或兩種以上的高分子鏈接枝在培基表面形成的刷狀體系.由于兩種高分子的化學性質不同，在不同的外界刺激條件下(溫度、pH、光照等)，高分子混合刷會出現各種微相結構，已被用于制備和設計響應性表面、蛋白質吸附、控制藥物釋放等領域[1].因此，高分子混合刷在實驗[2-4]、理論[5-7]和模擬[8-10]方面已被廣泛地研究.

應用高分子刷吸附/解吸附蛋白質，一直是高分子刷設計領域具有挑戰性的課題之一[11].Delcroix 等人[12]設計了一種由中性高分子 PEO 和帶負電荷的聚電解質高分子 PAA 接枝而成的高分子混合刷吸附蛋白質.研究發現，通過改變 pH，可以控制 PAA 鏈的溶脹、塌縮，從而實現混合刷對蛋白質的吸附、解吸附.這種 PEO/PAA 高分子混合刷中溶脹后的 PAA 鏈可以高效地吸附 HSA 蛋白質；通過 pH 改變 PAA 的溶脹程度，并應用 PEO 鏈和蛋白質的排斥，這種刷不但可以靈敏地調控蛋白質的吸附量，而且還能夠實現對蛋白質的解吸附.不僅如此，Bratek-Skicki 等人[13]設計的 PEO/PAA 高分子混合刷還可以實現有選擇地吸附、解吸附蛋白質.合成由中性高分子和帶電荷的聚電解質高分子接枝而成的高分子混合刷，也已成為設計高分子刷重要的研究方向之一.應用溫敏性高分子聚異丙基丙烯酰胺 (PNIPAM) 和 PAA 接枝而成的高分子混合刷已經被設計[14]，并且發現，溫度能夠誘導 PNIPAM/PAA 高分子混合刷中 PNIPAM 的塌縮或溶脹，而 pH 可以調控 PAA 的構象行為，這為控制中性/聚電解質高分子混合刷的響應行為提供了一種新方案.雖然之前的理論在研究高分子刷吸附蛋白質方面已經取得了重要的成果[15-17]，但是，當前仍然沒有相關理論或模擬研究中性/聚電解質高分子混合刷對蛋白質的吸附/解吸附特性，并且新的實驗結果不斷呈現[13,18-20].

鑒于文獻[12,13]中新穎而有趣的實驗結果，在本文中，將應用分子理論[21,22]研究 pH、水合性誘導的中性/聚電解質高分子混合刷的構象轉變行為，以及中性/聚電解質高分子混合刷對蛋白質的吸附/解吸附特性，分析中性/聚電解質高分子混合刷對蛋白質的吸附/解吸附機制，為設計高分子混合刷納米材料提供理論依據.

2 分子理論模型

為了創建中性/聚電解質高分子混合刷對蛋白質的吸附/解吸附模型,假設兩種高分子鏈被均勻地接枝到培基表面(x-y平面)上，兩種鏈分布不均勻的方向是垂直于x-y培基表面z≥0方向，由中性高分子和聚電解質接枝而成的高分子混合刷體系中有八種組分，分別為：(A) 中性高分子鏈，(B) 帶負電荷的聚電解質鏈、蛋白質(p)、陰離子(-)、陽離子(+)、H+、OH-和水分子(w).假定體系包括Np條 A 和 B 高分子鏈，接枝密度為σA=σB=Np/Ar，每個高分子鏈有N=50個單體，每個分子單體體積為vpA=vpB=0.16nm3.考慮蛋白質為球形粒子，半徑為R=1.1 nm，蛋白質在溶液中的濃度為Cp=0.5 M.陰離子(-)、陽離子(+)和水分子的體積近似相等，可取值為vi=0.03nm3(i=-,+,w)，假定各種分子不均勻分布僅在垂直培基表面的方向(z≥0方向)上.

圖 1 中性高分子 A 和聚電解質高分子 B 混合刷吸附蛋白質(a)和解吸附蛋白質(b)系統.Fig.1 Schematic representations of mixed neutral /polyelectrolyte polymer brush toward protein adsorption (a) and desorption (b).

考慮中性高分子 A 和聚電解質 B 兩種高分子的構象熵，蛋白質、陰離子、陽離子、H+、OH-和水分子(w)的平動熵以及體系中各種相互作用，A、B 高分子混合刷體系單位面積的自由能可表示為

(1)

式中β表示1/kBT.

方程 (1) 右邊第一項表示 A 和 B 高分子鏈的構象熵，可以由下式給出為

(2)

式中Pi(α) (i=A,B)是 A 和 B 高分子鏈處于α構象態的幾率分布函數，由此函數可以計算任意 A、B 高分子鏈的結構函數和熱力學量.A、B 高分子鏈的平均體積分數可以表示為

(i=A,B)

(3)

式中vpi(z;α)表示 A 和 B 高分子處于α構象態時，A、B 分子鏈單體在z處的體積.

方程 (1) 中第二項表示 A 高分子鏈單體與溶劑分子、蛋白質之間的有效相互作用，以及體系對蛋白質的吸引勢，可以表示為

(4)

式中χ是 Flory 相互作用參數，表示 A 高分子鏈單體與水分子之間相互作用強度.χ>0 表示排斥相互作用，χ<0表示吸引相互作用[21,22]，本文中選取了不同χ描述 A 高分子與水分子間不同的水合作用.φw(z) 表示在距離培基表面z處水分子的定域體積分數.χp表示 A 高分子鏈單體與蛋白質之間排斥作用強度，可以取值為χp=1.5，φp(z)為蛋白質的定域體積分數.βUp(z) 可取為庫侖勢[23]，表示體系對蛋白質的吸引作用.

方程 (1) 右邊第三項表示 B 聚電解質分子酸堿反應平衡時的化學自由能，可由下式給出為

(5)

方程 (1) 右邊第五項表示水分子(w)、陽離子、陰離子、H+、OH-和蛋白質的平動熵，可以表示為

(6)

式中ργ(z) (γ=w,+,-,H+,OH-) 是各種分子距離培基表面z處的定域分子數密度，vγ為各分子的體積.

方程 (1) 第六項表示 A、B 高分子混合刷體系中各帶電體間的靜電相互作用，可由下式給出為

(7)

式中ψ(z)是靜電勢，ε是水的介電常數，τ可由體系電中性約束條件確定，<ρq(z)>是混合刷體系中總的電荷量，可以表示為

(8)

qpB表示 B 聚電解質單體所帶的電荷量，qγ(γ=+,-,H+,OH-) 為各種離子的電荷量，qp(z)=qpρp(z)為蛋白質的定域電荷量.

自由能方程 (1) 右邊最后一項表示排斥體積相互作用，可由下式給出為

(9)

式中π(z)表示與滲透壓相關的排斥作用力場，該力場可由以下不可壓縮性約束條件確定

(10)

體系電中性約束條件為

(11)

對Pi(α)(i=A,B) 取變分并最小化自由能可得

(12a)

(12b)

Li(i=A,B) 是歸一化常數，以保證滿足歸一化條件：∑αPi(α)=1，ni(α;z)dz是 A 和 B 高分子鏈處于α構象態時在z處的單體數目，對φp(z) 取變分并最小化自由能可得距離培基表面z處蛋白質體積分數為

φp(z)=φbulkexp[-βπ(z)vp-βψ(z)qp-βUp(z)]

(13)

式中φbulk=CpvpNa，Na為阿伏伽德羅常數.

對于靜電勢取變分可得一般形式的Poisson-Boltzmann方程:

(14)

B 聚電解質分子鏈帶電荷分數(解離度)可表示為

(15)

為了描述 A、B 高分子混合刷體系對蛋白質的驅動作用，可以引入體系對蛋白質的平均作用勢[23]，可表示為

(16)

平均作用勢描述了驅動蛋白質進出混合刷的各種作用強度總和.

以上方程中的未知量是靜電勢ψ(z) 和排斥力場π(z)，將方程 (12)-(15) 代入方程 (10)、(11) 可確定這兩個未知量，求解非線性方程的詳盡數值方案在文獻[21,22,24]中已給出.

3 結果與討論

為了考察中性(A)/聚電解質(B)高分子混合刷對蛋白質的吸附/解吸附特性,并討論物理機理.可以先確定高分子混合刷在吸附蛋白質的過程中，刷內 A 高分子和 B 聚電解質的構象轉變特性.實驗研究發現，由中性高分子 PEO 和帶負電荷的聚電解質高分子 PAA 合成的高分子混合刷，在 pH≈5.0時，可以實現蛋白質的吸附.為此，在中性/聚電解質高分子混合刷對蛋白質的吸附過程中，首先確定 A、B 高分子平均體積分數分布.

圖2呈現了在不同 pH 條件下，A 和 B 高分子的平均體積分數距離垂直培基表面方向z處的分布.從圖 2a 可以看出，在 pH=4～6 時，處于弱水合狀態下(χ=0.15)的 A 高分子鏈的平均體積分數，分布在離培基表面較近的窄距離處，表明 A 高分子形成塌縮狀結構分布于混合刷的內層.從圖 2b 可以看出，B 聚電解質鏈的平均體積分數分布較為寬廣，這意味著 B 分子鏈是處于溶脹狀態，形成了溶脹結構占據了混合刷的外層，隨著pH增大，B 分子鏈溶脹程度增加.在 2b 中，B 聚電解質鏈平均體積分數分布出現兩個峰值，這是由于，在距離培基表面附近處，B 聚電解質鏈很難解離帶電 (圖 2b 插入圖)，并受到塌縮的 A 分子鏈的排斥體積作用，致使部分 B 聚電解質分子單體分布于刷的底層(第一個峰值)；在混合刷的外層，B 聚電解質鏈解離度增加，帶有了較多的負電荷，由于 B 聚電解質鏈內的靜電排斥作用，使得 B 分子鏈溶脹，占據了刷的外層(第二個峰值).這表明，在 A、B 高分子混合刷內，B 聚電解質鏈對 pH 有很明顯的響應性.在 A、B 高分子混合刷吸附蛋白質的過程中，由于蛋白質分子帶有與 B 聚電解質相反的電荷，當pH增加時，中性的 A 高分子鏈塌縮，帶負電荷的 B 聚電解質鏈溶脹，并占據著混合刷的外層，由于蛋白質和 B 聚電解質帶電單體間的靜電吸引作用，混合刷實現對蛋白質的吸附.由此可見，pH 可以誘導 A 和 B 高分子鏈的構象發生轉變，從而調控中性/聚電解質高分子混合刷對蛋白質的吸附.

圖2 A、B 高分子的平均體積分數在垂直培基表面方向(z方向)的分布，接枝密度為：σi=0.1nm-2 (i=A,B)，蛋白質帶電量：qp=8e，χ=0.15.Fig.2 The average volume fraction of the grafted chains as a function of the distance from the substrate surface for the mixed neutral /polyelectrolyte polymer brushes composed of polymer species A (a) and B(b).The grafting density is σi=0.1nm-2 (i=A,B),protein is charged qp=8e and χ=0.15.

對于中性高分子(PEO或PNIPAM)，隨著溫度的升高，疏水性增強(中性高分子和水分子間氫鍵的形成、破壞，致使中性高分子的水合性改變[21])，當中性高分子 A 疏水性增加，有利于 A 分子鏈塌縮.對于帶負電荷的聚電解質高分子B，較大的 pH 使得 B 聚電解質分子鏈單體解離度增大[24]，表現為 B 聚電解質鏈單體帶電荷分數隨 pH 增大而增加，B 聚電解質分子鏈內增加的電荷量，會貢獻出較大的靜電排斥作用，有助于 B 聚電解質鏈溶脹.

為進一步理解上述現象的起源，可以考察中性/聚電解質高分子混合刷體系中的靜電勢.

從圖 3 可以看出，在不同pH條件下，A、B 高分子混合刷體系中的靜電勢呈現了負值.這表明，帶負電荷的 B 聚電解質由于感受到靜電排斥而有利于B聚電解質處于溶脹狀態；并且隨著pH增加，靜電勢負值越大，由此表明，隨著pH增加，B 聚電解質由于感受到靜電排斥會增加，這會導致聚電解質鏈的溶脹程度增大.此外，混合刷中還存在有A、B 兩種高分子間強烈的排斥體積作用，由于排斥體積作用，如果A高分子優先占據刷內底層空間，處于塌縮狀態，可以導致在較低 pH 條件B聚電解質處于溶脹狀態，這樣，pH 可以靈敏地調控蛋白質的吸附.

圖 3 在不同 pH 條件下，體系靜電勢在距離垂直培基表面方向的分布，其余參數與圖 2 相同Fig.3 Electrostatic potential as a function of distance from the substrate surface for different pH.All parameters are the same as those in Fig.2

圖 4 顯示了在 A、B 高分子混合刷吸附蛋白質的過程中，對應于不同pH和蛋白質帶電量，蛋白質體積分數在垂直培基表面方向的分布.從圖 4 可以看出，在 A、B 高分子混合刷吸附蛋白質的過程中，蛋白質體積分數在靠近培基表面處分布較少，在刷的外層分布較多，并呈現了相當均勻的分布.這些都表明了，在 A、B 高分子混合刷內，由于 B 聚電解質鏈的溶脹，使得蛋白質與 B 聚電解質間的靜電吸引作用增大，由此增加了 B 聚電解質對蛋白質的吸附幾率.隨著 pH增加，B 聚電解質鏈的溶脹程度增大(圖4a)，這樣增加了高分子混合刷對蛋白質的吸附量.圖4b 呈現了隨著蛋白質帶電量的增加，混合刷中蛋白質體積分數增大，這是由于，增加蛋白質分子的帶電量，則會增強 B 聚電解質鏈與蛋白質的靜電吸引作用，有利于高分子混合刷增大對蛋白質的吸附量.基于這一事實，可以推斷，當 A、B 高分子混合刷中 B 聚電解質鏈處于溶脹態時，對于不同帶電特性的蛋白質，會有不同的吸附量.Bratek-Skicki 等人[14]的實驗的確報道了 PEO/PAA 混合刷不僅可以吸附蛋白質，而且還可以有選擇性地吸附.

圖 4 蛋白質體積分數在垂直培基表面方向的分布(a)：qp=8e，(b)：pH=5其余參數與圖 2 相同.Fig.4 Local volume fractions of proteins as a function of the distance from substrate surface for(a)：qp=8e and (b)：pH=5.All parameters are the same as those in Fig.2.

為了進一步探索 A、B 高分子混合刷對蛋白質的吸附效應，可以考察蛋白質與 A、B 高分子混合刷體系對蛋白質的平均作用勢.

圖5 顯示了在不同pH和蛋白質帶電量條件下，A、B 高分子混合刷體系對蛋白質的平均作用勢分布.從圖 5 可以看出，平均作用勢在 A、B 高分子混合刷的外層呈現了較大的負值，而在刷的內層出現較大正值，由此表明，在混合刷的外層由于 B 聚電解質鏈的溶脹，蛋白質與 B 聚電解質間呈現了較強的吸引作用，正是這種吸引作用，驅動蛋白質從本體溶液中進入混合刷內，實現蛋白質的吸附.從圖 5 還可以看出，平均作用勢在刷的外層和內層都呈現了相當寬的分布，這表明，混合刷中 B 聚電解質鏈對蛋白質的吸附是均勻吸附(圖 4 展現了蛋白質在混合刷外層是均勻分布).在混合刷的內層，蛋白質與 A 高分子鏈呈現了較強的排斥，因此，在刷的內層，蛋白質分布極少(圖4).由此可見，B 聚電解質溶脹程度的增加，以及蛋白質帶電量的增大，都會在不同程度上影響平均作用勢，從而影響 A、B 高分子混合刷對蛋白質的吸附.

圖5 平均作用勢分布，參數與圖 2 相同.Fig.5 The mean potentials as a function of the distance from substrate surface.All parameters are the same as those in Fig.2

通過以上分析，在A、B 高分子混合刷中，A、B 高分子的構象特性決定著蛋白質的吸附.切換 A、B 高分子混合刷內 A、B 高分子的構象，由于蛋白質與 A 高分子鏈間的排斥，當 A 高分子處于溶脹態，B 聚電解質塌縮時，蛋白質會被排斥，這樣可以實現蛋白質的解吸附.

圖 6 呈現了在 A 高分子與水分子間不同水合作用條件下，A、B 高分子的平均體積分數的分布.從圖 6a 可以看出，在較強水合作用條件下，A 高分子形成了較為溶脹結構分布于混合刷的外層，B 分子鏈是處于較為塌縮的狀態，形成了塌縮結構分布在混合刷的內層.隨著水合作用的增強，A 高分子鏈溶脹程度增加，因此蛋白質與 A 高分子鏈間的排斥作用增強；同時，由于 B 聚電解質塌縮，蛋白質與 B 聚電解質鏈間的靜電吸引作用減弱，這樣混合刷可以實現對蛋白質的解吸附.

圖 6 A 、B 高分子的平均體積分數在垂直培基表面方向(z方向)的分布，接枝密度為：σi=0.1nm-2 (i=A,B)蛋白質帶電量：qp=8e，pH=3.Fig.6 The average volume fractions of the grafted chains as a function of the distance from the surface for the mixed neutral /polyelectrolyte polymer brushes composed of polymer species A and B.The grafting density is σi=0.1nm-2 (i=A,B),protein is charged qp=8e and pH=3.0.

圖 7 顯示了在 A 高分子較強水合性條件下，蛋白質體積分數與平均作用勢的分布.從圖 7a 可以看出，蛋白質體積分數在刷內分布，遠少于 B 聚電解質鏈溶脹時蛋白質的體積分數(圖4a).圖 7b 中的平均作用勢呈現了很高的排斥作用勢壘，這表明，在混合刷內，由于 A 高分子鏈的溶脹，使得蛋白質與 A 高分子鏈間的排斥作用增大，因此蛋白質很難進入混合刷內，即對應著 A、B 混合高分子刷對蛋白質的解吸附，這與 Delcroix 等人[13]的實驗結論一致.

4 結 語

在本文中，我們基于分子理論，研究了中性(A)/聚電解質(B)高分子混合刷對蛋白質的吸附/解吸附特性.理論模型考慮蛋白質與中性高分子 A 的排斥作用、以及與聚電解質 B 的靜電吸引作用.研究發現，A、B 高分子混合刷在pH=4～6、中性高分子 A 處于弱水合狀態時，A 高分子形成的塌縮層，B 聚電解質溶脹，占據于刷的外層.由于蛋白質和 B 聚電解質間的靜電吸引，導致蛋白質從本體溶液中進入混合刷內，實現 A、B 高分子混合刷對蛋白質的吸附.因此，pH 可以調控 A 和 B 高分子鏈的構象，從而調節高分子混合刷對蛋白質的吸附.在 A 高分子水合性增強的條件下，A 高分子形成了溶脹結構占據了混合刷的外層，B 聚電解質鏈塌縮處在混合刷的內層.由于蛋白質與 A 高分子鏈間的排斥勢壘，隨著水合作用的增強，A 高分子鏈溶脹程度增大；同時，由于 B 高分子鏈塌縮，蛋白質與 B 聚電解質鏈間的靜電吸引減弱，這樣混合刷對蛋白質解吸附.

在本文中我們只考慮了 B 聚電解質和蛋白質間的靜電吸引作用、A 高分子和蛋白質的排斥作用[25]，事實上，蛋白質和高分子鏈間還存在范德瓦爾斯力等其他相互作用[26]，并且，蛋白質分子帶電量會隨著 pH 的變化而改變，實驗中的 HSA 蛋白帶電量的等電點為pH=4～6[11]，本文中考慮蛋白質分子的帶電量是固定值.理論結果符合實驗觀測，由此表明，A 和 B 高分子鏈的構象轉變，導致蛋白質與 A 高分子鏈間的排斥、以及蛋白質與 B 聚電解質鏈間的靜電吸引的改變，是中性/聚電解質高分子混合刷對蛋白質的吸附/解吸附的本質特性.