胰高血糖素樣肽-1對高糖條件下腎小球血管內(nèi)皮細胞損傷的調(diào)節(jié)作用及機制研究

黃強 韓強

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥、也是導致終末期腎臟病的主要病因。近年來，我國糖尿病的發(fā)生率逐年升高且糖尿病患者的血糖控制達標率較低，這也直接導致了DN發(fā)患者數(shù)的增加[1,2]。DN的發(fā)病機制復雜，其中高糖環(huán)境下腎小球系膜細胞增生、內(nèi)皮細胞損害、細胞外基質(zhì)增厚及重塑是公認的與DN發(fā)生直接相關的病理環(huán)節(jié)，針對以上病理環(huán)節(jié)進行干預也是DN治療的潛在靶點。胰高血糖素樣肽-1(glucagon like peptide-1，GLP-1)是由空腸和回腸L細胞分泌的小分子多肽，能夠以葡萄糖依賴性的方式刺激胰島素分泌并起到降糖作用。新近的多項細胞實驗研究證實，GLP-1對高糖、過氧化氫、缺氧等病理因素引起的內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用[3-5]，也有動物實驗證實GLP-1對糖尿病大鼠的腎功能具有改善作用，但GLP-1是否能夠減輕高糖環(huán)境下腎小球內(nèi)皮細胞的損傷尚未明確。為此，本研究選擇人源腎小球微血管內(nèi)皮細胞(HRGEC)作為實驗對象，具體分析了GLP-1對高糖條件下HRGEC損傷的調(diào)節(jié)作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑:HRGEC細胞購自ATCC公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶均購自Gibco公司，GLP-1購自Sigma公司，TUNEL染色試劑盒、一氧化氮(NO)檢測試劑盒購自上海碧云天公司，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)檢測試劑盒購自南京建成研究所，培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒、FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑、Talent熒光定量檢測試劑盒購自北京天根公司。

1.1.2 實驗儀器：細胞培養(yǎng)箱、高速離心機購自Thermo公司，熒光顯微鏡購自Nikon公司，熒光定量PCR儀購自Bio-rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組干預方法：HRGEC細胞用含有10%FBS、1%青霉素、1%鏈霉素的DMEM培養(yǎng)，細胞融合至80%后用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。傳代后得到足夠數(shù)量的對數(shù)生長期HRGEC細胞，進行分組處理，具體如下：①對照組用含有5.5 mol/L葡萄糖的DMEM處理；②高糖組：用含有30 mmol/L葡萄糖的DMEM處理；③GLP-1組：用含有30 mmol/L葡萄糖及30 nmol/L GLP-1的DMEM處理。

1.2.2 細胞凋亡率的檢測方法：不同條件處理后24 h，用4%多聚甲醛固定細胞過夜后采用TUNEL試劑盒中的TUNEL染色液和DAPI染色液對細胞進行染色，在顯微鏡下觀察TUNEL陽性染色細胞數(shù)目及DAPI陽性染色細胞數(shù)目后計算凋亡率。

1.2.3 細胞中基因mRNA表達的檢測方法：不同條件處理后24 h，收集細胞后采用北京天根公司的試劑盒分離細胞中的總RNA，以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取cDNA 1 μl、5 μmol/L的上游引物溶液及下游引物溶液各0.5 μl、Talent熒光定量檢測試劑盒中的反應液10 μl及去離子水8 μl，混勻后在PCR儀中進行熒光定量PCR反應，根據(jù)熒光曲線并以β-actin為內(nèi)參計算FasL、Fas、Bax、Bcl-2、Caspase-3、SIRT1、eNOS、NOX4的mRNA表達水平。

1.2.4 培養(yǎng)基中氧化應激指標及NO的檢測方法:不同條件處理后24 h，收集細胞培養(yǎng)基后采用南京建成研究所的試劑盒測定MDA、SOD、GSH的含量，采用上海碧云天的試劑盒測定NO含量。

2 結(jié)果

2.1 3組間細胞凋亡率的比較 對照組、高糖組和GLP-1組的細胞凋亡率分別為(6.23±0.94)%、(26.62±5.28)%、(11.75±2.03)%。高糖組的細胞凋亡率明顯高于對照組，GLP-1組的細胞凋亡率明顯低于高糖組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 3組間細胞凋亡率的比較；與對照組比較，aP<0.05；與高糖組比較，bP<0.05

2.2 3組間凋亡基因表達比較 高糖組細胞中FasL、Fas、Bax、Caspase-3的mRNA表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，Bcl-2的mRNA表達水平明顯低于對照組(P<0.05)；GLP-1組細胞中FasL、Fas、Bax、Caspase-3的mRNA表達水平明顯低于高糖組(P<0.05)，Bcl-2的mRNA表達水平明顯高于高糖組(P<0.05)。見表1。

組別FasL/β-actinFas/β-actinBax/β-actinBcl-2/β-actinCaspase-3/β-actin對照組 1.02±0.161.04±0.180.97±0.131.01±0.150.99±0.12高糖組 1.89±0.28*2.05±0.37*2.18±0.41*0.51±0.09*1.78±0.26*GLP-1組1.44±0.22#1.55±0.21#1.61±0.29#0.78±0.12#1.38±0.19#

注：與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05

2.3 3組間氧化應激指標的比較 高糖組細胞培養(yǎng)基中MDA的含量明顯高于對照組(P<0.05)，SOD、GSH的含量明顯低于對照組(P<0.05)；GLP-1組細胞培養(yǎng)基中MDA的含量明顯低于高糖組(P<0.05)，SOD、GSH的含量明顯高于高糖組；組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

組別MDA(μmol/L)SOD(U/ml)GSH(U/ml)對照組 2.41±0.3631.26±5.5825.63±4.24高糖組 11.77±1.84*14.51±2.37*12.67±2.17*GLP-1組4.95±0.77#20.93±3.85#19.48±3.27#

注：與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05

2.4 3組間SIRT1信號通路比較 高糖組細胞中SIRT1、eNOS的mRNA表達水平及細胞培養(yǎng)基中NO的含量明顯低于對照組(P<0.05)，細胞中NOX4的mRNA表達水平明顯高于對照組(P<0.05)；GLP-1組細胞中SIRT1、eNOS的mRNA表達水平及細胞培養(yǎng)基中NO的含量明顯高于高糖組(P<0.05)，細胞中NOX4的mRNA表達水平明顯低于高糖組(P<0.05)。見表3。

組別SIRT1/β-actineNOS/β-actinNO(μmol/L)NOX4/β-actin對照組 1.03±0.171.01±0.158.48±1.211.05±0.17高糖組 0.44±0.09*0.53±0.09*3.44±0.61*2.19±0.36*GLP-1組0.76±0.12#0.82±0.12#6.86±0.94#1.44±0.20#

注：與對照組比較，*P<0.05；與高糖組比較，#P<0.05

3 討論

腎小球血管內(nèi)皮細胞在高糖環(huán)境下發(fā)生損傷是DN發(fā)病的重要病理環(huán)節(jié)，針對高糖誘導的腎小球血管內(nèi)皮細胞損傷進行干預是治療DN的有效靶點[6,7]。GLP-1是一類新型的降糖藥物，通過葡萄糖依賴性的方式刺激胰島素分泌來起到降糖作用；新近也有研究表明，GLP-1對血管內(nèi)皮細胞具有保護作用，能夠減輕高糖、過氧化氫、缺氧等病理因素引起的內(nèi)皮細胞損傷。但是，GLP-1對高糖引起的腎小球血管內(nèi)皮細胞損害是否具有保護作用并未闡明。本研究以HRGEC細胞作為實驗對象，用高糖培養(yǎng)基處理后觀察到：高糖組的細胞凋亡率明顯高于對照組，提示HRGEC細胞在高糖環(huán)境下發(fā)生了過度凋亡；在高糖誘導HRGEC細胞凋亡的基礎上聯(lián)合使用GLP-1進行干預后觀察到：GLP-1組的細胞凋亡率明顯低于高糖組，表明GLP-1對高糖誘導的HRGEC細胞凋亡具有顯著抑制作用，進而也表明GLP-1對HRGEC具有保護作用。

死亡受體凋亡途徑和線粒體凋亡途徑是內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡的兩種不同機制，前者受到Fas/FasL的調(diào)控、后者受到Bcl-2/Bax的調(diào)控。FasL與Fas結(jié)合后通過細胞內(nèi)的FADD結(jié)構(gòu)域來招募Caspase-8，促進Caspase-8及下游信號發(fā)生級聯(lián)激活，最終引起Caspase-3活化[8,9]；Bcl-2和Bax通過調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)細胞色素C的釋放來影響Caspase-9的激活，前者阻礙Caspase-9激活、后者促進Caspase-9激活，進而改變下游信號的級聯(lián)激活及Caspase-3的活化。兩種不同機制均最終引起Caspase-3的活化并啟動細胞凋亡[10,11]。本研究對HRGEC細胞中以上凋亡基因表達的分析顯示：高糖組細胞中FasL、Fas、Bax、Caspase-3的mRNA表達水平明顯高于對照組，Bcl-2的mRNA表達水平明顯低于對照組，提示高糖能夠使HRGEC細胞的死亡受體凋亡途徑和線粒體凋亡途徑均發(fā)生過度活化。在使用GLP-1干預后觀察到：GLP-1組細胞中FasL、Fas、Bax、Caspase-3的mRNA表達水平明顯低于高糖組，Bcl-2的mRNA表達水平明顯高于高糖組，表明GLP-1對高糖誘導的死亡受體凋亡途徑和線粒體凋亡途徑激活具有抑制作用。

高糖環(huán)境除了能夠通過促進細胞凋亡來引起內(nèi)皮細胞損傷外，還能通過增加氧自由基的生成來引起內(nèi)皮細胞發(fā)生氧化應激損傷。氧自由基具有極強的氧化性，能夠與內(nèi)皮細胞膜結(jié)構(gòu)中的多種成分發(fā)生氧化反應并造成膜結(jié)構(gòu)的破壞，細胞膜的破壞會造成細胞結(jié)構(gòu)損害、線粒體膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的破壞會造成細胞功能損害[12]。細胞膜及細胞器膜中含有豐富脂質(zhì)，與氧自由基發(fā)生氧化反應后生成MDA；細胞本身含有SOD、GSH等抗氧化物，在催化氧自由基發(fā)生發(fā)生還原反應的過程中大量消耗[13,14]。本研究對HRGEC細胞培養(yǎng)基中上述氧化應激產(chǎn)物的分析顯示：高糖組細胞培養(yǎng)基中MDA的含量明顯高于對照組，SOD、GSH的含量明顯低于對照組，提示高糖能夠引起HRGEC細胞中氧化應激反應的過度激活。在使用GLP-1干預后觀察到：GLP-1組細胞培養(yǎng)基中MDA的含量明顯低于高糖組，SOD、GSH的含量明顯高于高糖組，表明GLP-1對高糖誘導的氧化應激具有抑制作用。

內(nèi)皮細胞凋亡及氧化應激的調(diào)控與細胞內(nèi)多條信號通路有關，其中SIRT1通路既能通過調(diào)節(jié)eNOS的表達及NO的生成來發(fā)揮抗凋亡作用，也能通過抑制NOX4的表達來起到抗氧化應激作用。eNOS是特異性表達于內(nèi)皮細胞的NOS分子，在催化精氨酸代謝的過程中產(chǎn)生NO并通過NO 的活性來保護內(nèi)皮、抑制凋亡[15,16]；NOX4是內(nèi)皮細胞中催化活性氧產(chǎn)生的NOX家族分子，SIRT1通過抑制NOX4的表達、減少活性氧的產(chǎn)生來抑制內(nèi)皮的氧化應激損傷[17,18]。本研究對HRGEC細胞培養(yǎng)基中上述SIRT1通路的分析顯示：高糖組細胞中SIRT1、eNOS的mRNA表達水平及細胞培養(yǎng)基中NO的含量明顯低于對照組，細胞中NOX4的mRNA表達水平明顯高于對照組；而GLP-1干預后GLP-1組細胞中SIRT1、eNOS的mRNA表達水平及細胞培養(yǎng)基中NO的含量明顯高于高糖組，細胞中NOX4的mRNA表達水平明顯低于高糖組。這一結(jié)果表明GLP-1能促進高糖條件下HRGEC細胞中SIRT1通路的激活，這也可能是GLP-1發(fā)揮抗凋亡及抗氧化應激的分子機制。

綜上所述，GLP-1能夠減輕高糖條件下HRGEC的凋亡及氧化應激，同時也能促進SIRT1信號通路的激活；激活SIRT1信號通路可能是GLP-1發(fā)揮抗凋亡及抗氧化應激的分子機制。