阿司匹林對腦缺血損傷大鼠JAK/STAT信號通路的影響

孫永 孫輝 姚凱華 李志鋒 李永文

缺血性腦血管病因其具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率和高復發(fā)率等特點對人類的生命和健康威脅甚大，已成為危害人類生命的第三大殺手[1]。腦缺血性損傷是缺血性腦血管病中重要的病理生理過程[2]。阿司匹林是臨床最常用的具有解熱鎮(zhèn)痛的非甾體類抗炎藥物；研究表明阿司匹林可增強腦部血流循環(huán)，防止因腦缺血造成腦梗死的發(fā)生[3]。另有研究表明，阿司匹林還可改善缺血部位的能量代謝，參與抑制神經細胞的凋亡過程[4]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)JAK/STAT信號轉導通路與腦缺血有密切關聯(lián)，是調節(jié)腦缺血后腫瘤壞死因子-α、白介素等造成腦缺血后細胞損傷的細胞因子反應的關鍵通路[5]。JAK2/STAT3通路的激活可能介導缺血腦損傷神經元的凋亡過程。阿司匹林對腦缺血損傷大鼠JAK/STAT信號通路的影響筆者所見鮮有報道。因此本實驗通過建立大鼠局灶性腦缺血性損傷模型，研究大鼠局灶性腦缺血性損傷后以及不同濃度阿司匹林干預后JAK2、磷酸化 JAK2(pJAK2)、STAT3、磷酸化 STAT3 (pSTAT3)蛋白水平表達變化及神經細胞凋亡的情況，旨在探討阿司匹林對腦缺血性損傷大鼠JAK/STAT信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 12～15周齡的無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級健康SD雄性大鼠100只(合格證號：SCXK京2006-0009)，體重200～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；阿司匹林購自上海先聲藥業(yè)有限公司；JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3 多克隆抗體均來自美國 Bioworld 公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔/兔抗小鼠IgG購自美國 Sigma公司，小鼠抗大鼠 β-actin抗體、TUNEL法細胞凋亡檢測試劑盒 、DAB顯色試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；磁共振掃描儀購自德國西門子公司；凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司；BXM-950光學顯微鏡購自上海炳宇光學儀器有限公司；CM1850石蠟切片機購自北京德泉興業(yè)商貿有限公司；蛋白印跡設備購自美國Bio Rad公司。

1.2 模型構建與分組處理 將80只大鼠進行編號，隨機分為4組，每組20只，分別為假手術組、模型組、阿司匹林低劑量組(10 mg/kg)、阿司匹林高劑量組(50 mg/kg)。模型構建：大鼠麻醉后，取0.285 mm直徑的尼龍線，參照文獻[6]，用絲線將頸外動脈和頸總動脈結扎，將準備好的尼龍繩沿頸總動脈插入右側頸內動脈后，松開血管夾，推進線栓約 9 mm 左右阻塞同側的大腦中動脈；在右側頸總動脈切口上方固定線栓，完成大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)造模。假手術組不做血管結扎或阻塞，其余操作同模型組。4組大鼠灌注術后第1天開始腹腔注射給予相應藥物，每天1次，連續(xù)給藥7 d，假手術組和模型組腹腔給予等量無菌0.9%氯化鈉溶液。見圖1。

1.3 神經功能缺損程度(mNNS)評分 第7天給藥30 min后，參考文獻[6]采用改良的mNNS評分方法，將大鼠行為分為7個等級，評分標準：0分：大鼠爬行正常，沒有不對稱活動；1分：大鼠尾部垂直提起時前肢或后肢彎曲；2分：大鼠在1分的基礎上伴有不能直線行走；3分：大鼠爬行時向左側轉圈；4分：大鼠自由活動時向左側傾倒；5分：大鼠在4分的基礎上出現(xiàn)左前爪后拖；6分：大鼠肢體完全不能支撐身體，無法自發(fā)爬行。

圖1 線栓法制備MCAO手術過程；A：仔細分離頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈；B：結扎頸總動脈和頸外動脈；C：夾住頸內動脈；D：后切開頸總動脈，從頸總動脈插入螺紋，然后松開動脈夾，將線插入頸內動脈；E：固定線；F：縫合皮膚

1.4 磁共振(MRI)法測量腦梗死體積 大鼠經神經功能缺損程度評分結束后，使用磁共振掃描儀檢測腦梗死體積，大鼠取仰臥位，找到標準軸位后，在橫斷面T2-加權成像的基礎上進行冠狀面3層掃描，層厚度1.5 mm，間距0.2 mm。T2-加權成像檢測大鼠腦梗死體積，梗死區(qū)域為蒼白色，正常腦組織區(qū)域為灰色。利用Image J分析軟件計算腦梗死體積(%)=(梗死區(qū)體積/全腦組織體積)×100%。

1.5 TUNEL 法檢測細胞凋亡 取大鼠梗死部位腦組織，放入 4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟常規(guī)包埋并在組織切片機上做連續(xù)6 μm 切片按試劑盒步驟進行TUNEL染色。主要步驟為切片脫蠟水化后， 蛋白酶 K(10 mmol/L)處理20 min，PBS 清洗5 min×3次，將載玻片浸入TUNEL反應混合物在37℃下避光溫育60 min，PBS清洗5 min×3 次；在 37℃ 下，用POD反應液避光溫育30 min；PBS 清洗 5 min×3 次；滴加 DAB 底物溶液顯色，室溫孵育10 min，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察神經元凋亡情況。以顯示藍色的核染色為正常細胞，細胞核中有棕黃色顆粒為陽性細胞(凋亡細胞)。凋亡神經元所占百分比(凋亡率)：每只大鼠取 4 張切片，每張切片在200 倍視野下隨機選取 3 個不重疊視野，每個視野計數(shù)陽性細胞占總細胞的比例，取平均值。

1.6 Western Blot檢測JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3 取新鮮梗死部位腦組織加入RIPA組織裂解液中勻漿器打碎，冰浴5 min后離心，離心條件：13 000 r/min，4℃，時間10 min，獲得上清，BCA蛋白定量試劑盒進行上清中蛋白濃度的定量檢測，用2×電泳緩沖液稀釋蛋白至相同濃度。10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)分離蛋白，用Tris/甘氨酸緩沖液將蛋白轉移至PVDF膜上，5%TBST液中室溫封閉2 h，將PVDF膜放入相應一抗稀釋液(均為1∶1 000)中孵育，4℃過夜。次日，將膜取出，TBST液洗滌10 min，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗稀釋液(均為1∶10 000)，室溫孵育2 h，加入DAB發(fā)光液，凝膠成像儀下讀取讀取灰度值，以GAPDH作為內參，計算目的蛋白相對表達水平。

2 結果

2.1 神經功能學評分 假手術組大鼠評分為0，即無明顯神經功能萎縮現(xiàn)象；其他組都存在不同程度的神經功能缺損，還出現(xiàn)了精神萎靡、反應遲鈍和進食減少等狀況。與假手術組相比，模型組大鼠神經功能損傷評分明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與模型組相比，阿司匹林高、低劑量組神經功能損傷評分出現(xiàn)明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，阿司匹林高劑量組效果更為明顯，與低劑量組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 阿司匹林對大鼠癥狀學評分的影響 n=20,分,

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與阿司匹林低劑量組比較，△P<0.05

2.2 阿司匹林對MCAO大鼠腦梗死體積的影響 假手術組大鼠兩側腦組織未發(fā)現(xiàn)梗死區(qū)域，與假手術組相比，模型組腦梗死體積明顯增大(P<0.05)；與模型組相比，阿司匹林高、低劑量組腦梗死體積明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，阿司匹林高劑量組效果更為明顯，與低劑量組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2，圖2。

組別腦梗死體積假手術組 0.00模型組 53.51±4.31*阿司匹林低劑量組36.81±3.21#阿司匹林高劑量組25.12±3.10#△

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與阿司匹林低劑量組比較，△P<0.05

圖2 阿司匹林對MCAO大鼠腦梗死體積的影響;A假手術組;B模型組;C阿司匹林低劑量組;D阿司匹林高劑量組

2.3 阿司匹林對MCAO大鼠腦內神經細胞凋亡的影響 假手術組大鼠中出現(xiàn)少量凋亡細胞；與假手術組相比，缺血性模型組于術后24 h可見大量凋亡細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，阿司匹林治療后，與模型組相比，阿司匹林高、低劑量組凋亡細胞數(shù)明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)，阿司匹林高劑量組效果更為明顯，與低劑量組相比差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。見圖3，表3。

2.4 阿司匹林對MCAO大鼠JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3蛋白表達的影響 為了進一步觀察阿司匹林對大鼠缺血腦梗死的作用機制，本研究采用蛋白免疫印跡法檢測了缺血區(qū)腦組織中JAK2、pJAK2、STAT3、

圖3 阿司匹林對MCAO大鼠神經細胞凋亡的影響;A假手術組;B模型組;C阿司匹林低劑量組;D阿司匹林高劑量組

組別凋亡率假手術組 10.23±2.19模型組 46.24±3.24*阿司匹林低劑量組35.67±3.02#阿司匹林高劑量組24.78±3.22#△

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與阿司匹林低劑量組比較，△P<0.05

pSTAT3蛋白表達，結果顯示與假手術組相比，模型組中pJAK2、pSTAT3表達水平明明顯升高(P<0.05)；阿司匹林治療后，與模型組相比，阿司匹林高、低劑量組pJAK2、pSTAT3表達水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)，阿司匹林高劑量組下降更為明顯，與低劑量組相比差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。見圖4，表4。

圖4 阿司匹林對MCAO大鼠JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3蛋白表達的影響

組別JAK2pJAK2STAT3pSTAT3假手術組 0.41±0.050.11±0.024.49±0.136.15±0.15模型組 0.38±0.040.58±0.07*4.46±0.0415.21±0.12*阿司匹林低劑量組0.42±0.050.39±0.06#4.48±0.1112.35±0.26#阿司匹林高劑量組0.41±0.060.14±0.03#△4.51±0.118.71±0.22#△

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與阿司匹林低劑量組比較，△P<0.05

3 討論

大腦供血的動脈發(fā)生狹窄或阻斷時，會導致腦組織因供血供氧不足出現(xiàn)局部缺血甚至壞死，大腦功能受到損害，對機體的生理活動產生嚴重不良影響[7]。缺血性腦梗死與心血管疾病和惡性腫瘤并列成為對人類生命構成極大威脅的致死性疾病[8]。

阿司匹林的神經保護機制與改善腦組織的能量代謝、減少自由基生成、抑制興奮性氨基酸的神經毒性有關，臨床研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林可顯著降低心肌梗死及腦卒中的發(fā)病率[9]。本研究給予MCAO大鼠不同濃度阿司匹林治療后，與模型組相比，腦梗死體積明顯縮小，神經功能損傷程度明顯減輕，同時抑制了神經細胞凋亡的數(shù)量，大鼠局部腦缺血損傷得到緩解，該結果與既往實驗結果[10]一致，再次證實了藥物的治療效果。

JAK/STAT信號通路將來自細胞外的化學信號傳遞給細胞核，導致與免疫、增殖、分化和凋亡等相關的基因的DNA轉錄和表達[11]。在JAK/STAT信號通路中，細胞外信號與細胞膜上的細胞因子受體結合后活化JAK催化受體發(fā)生酪氨酸磷酸化形成pJAK，pJAK與細胞膜上的受體相偶聯(lián)后發(fā)生酪氨酸磷酸化，STAT蛋白與受體結合，在pJAK的催化下發(fā)生磷酸化形成pSTAT[12]。pSTAT與受體親和力較低，因此pSTAT與受體分離，形成二聚體的活性形式轉移到細胞核內，并結合到啟動子上誘導相應基因表達，完成信號傳導過程，可直接影響相關基因的表達，進而改變靶細胞的增殖或分化狀態(tài)[13]。JAK2/STAT3是JAK/STAT信號通路的一種，已有研究表明腦缺血性腦損傷會釋放大量的炎性細胞因子如IL-2、IL-6可使 JAK2/STAT3信號通路激活[14]。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化的JAK2、STAT3蛋白表達量與神經元凋亡的時間段和部位基本一致[15]。Yu等[16]發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血性24 h后海馬CA1區(qū)神經元凋亡數(shù)隨著pSTAT3 蛋白表達的增加而增多。Huang等[17]通過對STAT3基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)STAT3在小鼠腦缺血中會干擾基因轉錄，影響突觸傳遞，改變細胞結構及影響細胞代謝等。因此，抑制JAK2/STAT3信號通路激活抑制能夠顯著減少神經細胞凋亡，縮小腦梗死體積，改善神經功能缺損，具有明顯的腦保護作用。

研究藥物的分子機制，探尋藥物作用的靶點有利于藥物的使用及藥物的優(yōu)化。阿司匹林的神經保護機制具體機制上不清楚。Shen等[18]發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血性損傷后經灌胃阿司匹林，大鼠腦梗死體積減小，且JAK2磷酸化水平下降，推測阿司匹林可能通過JAK2介導的信號通路發(fā)揮大腦神經的保護作用。本研究通過對JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血性損傷后，腦組織中pJAK2、pSTAT3 表達顯著上調。與模型組比較，阿司匹林干預后pJAK2、pSTAT3表達降低，細胞凋亡減少，神經功能缺損得到明顯改善，與既往研究結果相似。

綜上所述，大鼠腦缺血性損傷后可能引發(fā)了 JAK2、STAT3的活化；阿司匹林可能通過抑制JAK2/ STAT3 信號通路的活化，從而抑制神經細胞凋亡，改善缺血性對大鼠的神經功能缺損，減輕腦神經細胞的損傷，發(fā)揮神經保護作用。但阿司匹林是否還能通過調節(jié)其他通路來影響疾病進程，仍需進一步的研究。