霍山石斛多酚氧化酶活力測定條件的優(yōu)化

張珍林，孫 立，王夢荷，劉 帥

(1.皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽 六安 237012；2.植物細胞工程安徽省工程技術研究中心，安徽 六安 237012；3.安徽省中藥資源保護與持續(xù)利用工程實驗室，安徽 六安 237012)

霍山石斛(學名：DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)俗稱米斛，是中國特有、蘭科石斛屬的草本植物，為國家一級保護植物，中國國家地理標志產品[1](P117)。主要產于安徽省霍山縣，屬大別山區(qū)，大多成長于云霧繚繞的絕壁上，崖石縫隙間和高大樹木之上，山地林中樹干上或者山谷中巖石上[2]。

據《中華人民共和國藥典》記載[3](P70)，霍山石斛鮮品能大幅度地提高人體內超氧化物歧化酶(SOD)水平，有效地延緩衰老，對過度熬夜、經常用腦、吸煙飲酒太過，身虛力乏者，頻繁食用十分相宜。而且霍山石斛鮮品對眼睛有明目作用，甚至能起到調和陰陽、壯陽補腎以及美容養(yǎng)顏之功效。所以近年來，模擬霍山石斛自然生長環(huán)境的大棚種植在不斷增加，產量得到了大幅度增高，但貯藏保鮮及商品化處理技術仍跟不上鮮品上長的量，霍山石斛采后鮮品的狀況仍未有很好的改善，多數只能采用干制技術來提高保存期[4-5]，這也使得霍山石斛產品價格偏高。因此，研究霍山石斛鮮品的保鮮手法和工藝，延長其有效保鮮期，對促進霍山石斛鮮品產業(yè)發(fā)展具有深遠確切的意義。

大量研究認為，植物鮮品不易保藏，這和病理、生理因素分不開[6-8]，也和鮮品不同采收期分不開[9-10]。研究霍山石斛在不同生長階段體內活性物質的變化，這和過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)主要體系酶關系極為密切，酶是霍山石斛鮮品抗氧化作用功效體現的物質基礎，但也是易導致植物體采后褐變，品質變差的物質基礎，所以，鈍化酶的活性在生產上常見，主要用超高壓熱燙、高溫熱燙、低溫冷藏以及氣調保鮮等技術手段，以其達到滅酶保鮮[11]。

本實驗旨在研究提取不同生長期采收的霍山石斛主要酶以及測定酶活，為深入了解霍山石斛生長過程中主要酶活性動態(tài)變化情況，以及實體加工業(yè)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霍山石斛一年生鮮條、三年生鮮條，由皖西學院安徽省中藥資源保護與持續(xù)利用工程中心提供。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、聚乙烯吡絡烷酮(PVP)、鄰苯二酚、30%飽和度硫酸銨等均為分析純，購于國藥化學集團試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

RE-52AA型旋轉蒸發(fā)器、高速組織搗碎機(上海凈信實驗設備科技部)、SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵、ZMD-2型電子分析天平、DHG-9101-1型電熱恒溫鼓風干燥箱、HH-4C型數顯恒溫水浴鍋、研缽、TU1901型紫外分光光度計、PHS-25型PH計、LDZX-50KBS型高壓蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-IBU型超凈工作臺、MIKRO120型小型臺式高速離心機。

1.3 試驗方法

1.3.1 粗酶液的提取

準確稱取霍山石斛鮮條一年生、三年生各5.00 g，加入0.5 g不溶性聚乙烯吡咯烷酮(事先用蒸餾水浸洗，然后過濾以除去雜質)和100 ml 0.1 mol/L磷酸緩沖液，混合并磨成勻漿，使用循環(huán)水式多用真空泵過濾，濾液中加入30%飽和度硫酸銨，用低溫離心機中5000 r/min離心10 min，分兩次離心，除沉淀，于上清液中再加入硫酸銨使其達到60%飽和度，再次離心收集沉淀。將所得沉淀溶于2～3 ml 0.01 mol/L磷酸緩沖液中，即得粗制酶液。

1.3.2 酶活性的測定

根據查閱文獻[12]，確定采用鄰苯二酚法測量霍山石斛多酚氧化酶活力。

在試管中加入3.9 ml 0.05 mol/L磷酸緩沖液，1.0 ml 0.1 mol/L兒茶酚在37 ℃恒溫水浴中保溫10 min，之后加入不同體積酶液進行酶活性測定(可視酶活性增減用量)，迅速搖勻，倒入比色皿內，將其于525 nm波長處，以時間掃描方式，在1～2 min時間內測定吸光度變化(A)值。

1.3.3 酶活力測定條件的優(yōu)化

根據本實驗初步研究目的，在測定酶活力過程中，對緩沖溶液的pH值、酶濃度、反應溫度、生長年限等單因素進行分析，考察單因素最佳范圍，再利用正交試驗優(yōu)化單因素，從而獲得多酚氧化酶酶活力最佳測定條件。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 緩沖溶液pH值

影響多酚氧化酶活力的因素緩沖液的pH值如圖1所示。由圖1得知當緩沖溶液的pH從6.0增加到6.5時，酶活力顯著增大。而繼續(xù)增加pH值之后，酶活力反而減小。在pH為6.5的時候，酶活力最大。所以pH為6.5是最佳水平。

圖1 緩沖液的pH值對多酚氧化酶活力的影響

分析實驗中所使用的緩沖溶液pH值對多酚氧化酶活力的影響，可以了解霍山石斛多酚氧化酶適合在中性或偏酸性的條件下存活，pH值過低不適合酶活性激發(fā)，過高也會抑制酶活性，過低過高都不能使酶活性達到最優(yōu)，所以根據單因素確定緩沖溶液pH值為6.5時是最優(yōu)酶活力測定值。

2.1.2 反應溫度

影響多酚氧化酶活力的因素反應溫度如圖2所示。看圖2得，當反應溫度從0 ℃上升到40 ℃時，酶活力顯著增大。但是在繼續(xù)升溫之后，酶活力反而會變小。在反應溫度為40 ℃的時候，酶活力最大。所以反應溫度40 ℃是最佳水平。

圖2 反應溫度對多酚氧化酶活力的影響

分析實驗過程中反應溫度對多酚氧化酶活力的影響，可以確定溫度的影響也是有最佳條件的，超過或不到最佳條件酶活性不能充分展現，只有在合適的溫度下才能達到最佳酶活力，本實驗條件下反應溫度為40 ℃是最佳。

2.1.3 酶濃度

影響多酚氧化酶活力的因素酶濃度如圖3所示。圖3顯示，在反應過程中，隨著加入的酶濃度逐漸增大，整個反應體系中酶活力增強。但當酶濃度達到1.0 ml時，再繼續(xù)增加酶濃度，酶活力增加趨于平緩直到不再變化，由此得出當酶濃度為1.0 ml時，酶活力達到最大。

圖3 酶濃度對多酚氧化酶活力的影響

分析酶濃度對多酚氧化酶活力的影響，圖3顯示在一定范圍內，酶濃度對酶活力的影響成正比，隨著酶用量的不斷增加，酶活力也逐漸增大。但是當酶溶液達到一定用量時，酶活力增加趨勢平緩，繼續(xù)增加酶濃度酶活力也不會再出現大幅度變化。由此確定霍山石斛多酚氧化酶的酶濃度為1.0 ml時最優(yōu)。

2.1.4 生長年限

霍山石斛生長年限對多酚氧化酶活力的影響如表1所示。由表1看出，從測定兩個生長年限的數據，生長年限為1年生的霍山石斛酶活力為28 U，生長年限為3年生的霍山石斛酶活力為72 U，3年生數據要明顯大于1年生的數據。

表1 生長年限對多酚氧化酶活力的影響

分析表1，可大致判斷，隨著霍山石斛生長年限的增加，多酚氧化酶活性是逐漸增加的，也即是多酚氧化酶酶活力呈現上漲趨勢，且明顯，所以后續(xù)在進行正交優(yōu)化酶活力測定條件時僅以3年生霍山石斛為檢測對象。不在作為正交優(yōu)化考慮因素。

2.2 正交實驗結果與分析

2.2.1 正交分析因素與水平

正交分析因素與水平見表2。

表2 正交分析因素與水平

2.2.2 正交結果與分析

根據得到的正交實驗統(tǒng)計表結果，見表3。

由表3可知，緩沖液的pH值、多酚氧化酶濃度和反應溫度這三個因素的極差大小順序為A>C>B，即霍山石斛多酚氧化酶活力測定三主要影響因素的作用大小順序為：緩沖液的pH值>多酚氧化酶濃度>反應溫度。霍山石斛多酚氧化酶活力測定的最佳條件為A3B1C2，即緩沖液的pH值為6.5，反應溫度為40 ℃，酶濃度為1.0 ml，生長年限為3年，所測得最高酶活力值為39.153 U。

表3 正交分析結果

3 討論與結論

石斛的生長需要適宜的自然條件，安徽六安霍山得天獨厚的地理環(huán)境和氣候優(yōu)勢起到非常重要的作用。植物組織中PPO都具有各自明顯紫外吸收特征，不同植物不同組織中PPO的紫外吸收峰也不相同，如康娟等在絲瓜多酚氧化酶及過氧化物酶酶學特性的研究中，指出絲瓜PPO的最大吸收波峰為408 nm[13]；趙東海等對蘑菇中多酚氧化酶的酶學特性研究中，指出蘑菇PPO的最大吸收峰為410 nm[14]。在本實驗中，對霍山石斛PPO的最大吸收峰為525 nm，當以鄰苯二酚為底物，濃度為0.1 mol/L，多酚氧化酶濃度為1.0 ml，緩沖液的pH值為6.5、反應溫度為40 ℃且生長年限為三年期時活性最高。

PPO作為各種植物的必要成分而存在，對它進行深入研究是很有必要，如柳素潔對香蕉多酚氧化酶性質及在果酒發(fā)酵中褐變控制的研究，明確了PPO是引起香蕉酶促褐變的主要因素并采取合適方法來抑制[15]；李全文對桑葉多酚氧化酶的提取、純化及其固定化研究，明確了桑葉PPO的制備[16]。霍山石斛是目前研究藥用性質極佳的一種多年生草本中藥，具有優(yōu)良的營養(yǎng)和保健價值，但由于種植條件要求高，加工中也存在很多困難，霍山石斛多為楓斗保健飲用，被加工制成其他產品形式的不多，尤其在食品工業(yè)上。霍山石斛加工中也存在酶促褐變，極易使產品品質劣變，影響產品市場，深入研究霍山石斛酶促褐變的因素及控制技術對闡明石斛褐變規(guī)律，促進霍山石斛加工技術的發(fā)展，提高產品的品質具有理論和實際意義，本實驗探討了霍山石斛中PPO的酶學特性，為后期霍山石斛PPO的分離、提取、純化和霍山石斛新產品的開發(fā)奠定了基礎。