用染發劑對小鼠進行染毒處理對其精子計數和精子畸形率的影響

張書琳，劉文文，何愛玲，崔圣瑩

（1.山東第一醫科大學臨床醫學院，山東 泰安 271000；2.山東第一醫科大學基礎醫學院，山東 泰安 271000；3.泰山療養院檢驗科，山東 泰安 271000；4.山東第一醫科大學教務處,山東 泰安 271000）

近年來，染發已成為人們的一種時尚選擇。大部分男性留短發，其染發的頻率要高于女性。部分有染發習慣的男性會每隔15～30 d染發1次。目前，市售染發劑主要可分為永久染發劑、半永久染發劑、脫色染發劑、臨時染發劑四大類。這些染發劑的染色原理不盡相同，但其主要成分均為對苯二胺(PPD)與雙氧水(H2O2)。這兩種成分的混合物對人體內的多種細胞均具有致畸變的作用。除此之外，染發劑中還含有鉛等有害物質。流行病學調查顯示，多種疾病的發生均可能與使用染發劑有關。相關的研究指出，染發劑可能對人體內的生殖細胞產生致畸變作用，從而影響生育。為了探討長期使用染發劑對生殖功能的危害，筆者進行了有關染發劑致小鼠精子畸形的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取30只SPF級昆明種健康成年雄性小鼠（由山東第一醫科大學臨床醫學院實驗動物中心提供，周齡為6～7周，體重為20～25 g）作為研究對象。將其飼養于獨立的通風換氣籠中，并將換氣籠中的溫度控制在20～25℃之間，將換氣籠中的濕度控制在50%～70%之間）。本研究經山東第一醫科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2 儀器、試劑和染發劑 本研究中所用的儀器、試劑和染發劑主要包括：恒溫水浴箱（購自天津市惠達實驗儀器有限公司）、顯微鏡（購自北京瑞宏誠科技有限公司）、血細胞計數板（購自北京瑞宏誠科技有限公司）、凡士林（購自東莞康爾維醫藥科技有限公司）、伊紅染料（購自河北博海生物工程開發有限公司）、甲醇（購自衡水廣康商貿有限公司）、生理鹽水（購自衡水廣康商貿有限公司）、植物永久性染發劑（由廣州某化妝品公司生產，批準文號：國妝特字G20120404）、氧化永久性染發劑（由廣州某化妝品公司生產，批準文號：國妝特字G20121106）。

1.2 染毒方法

采用完全隨機法將上述30只小鼠分為植物永久性染發劑組、氧化永久性染發劑組和對照組。為植物永久性染發劑組小鼠、氧化永久性染發劑組小鼠分別用植物永久性染發劑、氧化永久性染發劑進行染毒。方法是：按染發劑說明書中的配制方法配制染發劑，然后將其均勻地涂抹于小鼠的背部（涂抹面積為3 cm×3 cm）。染毒劑量為5 mg/g，每隔2 d染毒1次，連續染毒7次。為對照組小鼠在背部涂抹等量的凡士林，涂抹方法與上述染毒方法相同。

1.3 精子畸形率的測定方法

將三組小鼠于首次染毒或涂抹凡士林后的第30 d用頸椎脫臼法處死，剖開其腹腔，暴露其睪丸，分離其雙側附睪。然后將附睪標本放入盛有4 ml溫度為37℃生理鹽水的小平皿中。將小平皿置于37℃的恒溫水浴箱中（放置時間為20 min），使精子充分游離于生理鹽水中，形成精子懸液。然后取適量的精子懸液置于載玻片的一側，取另一片載玻片為推片，制作精子涂片。待涂片干燥后，將其放入甲醇溶液中固定5 min，然后取出晾干。用2%的伊紅水溶液對涂片進行15～20 min的染色，再用蒸餾水對其進行沖洗。在顯微鏡下對每組小鼠精子涂片上的500個精子進行觀察，并統計其中畸形精子的數量。精子畸形的主要類型包括：胖頭、尾折疊、無鉤、香蕉形、無定形、雙頭及雙尾等。無尾精子、頭部重疊或整個重疊的精子均不計數。精子的畸形率=精子畸形數/500×100%。

1.4 精子計數的測定方法

分別取每只小鼠的精子懸液10 μl，將其滴入血細胞計數板中。使精子懸液緩慢地流入計數室內。靜置5 min后將計數板放于顯微鏡的載物臺上，待精子不再游動后計數。在低倍鏡下找到計數室的中央大方格后，在高倍鏡下對每個計數室中左上、左下、中央、右上、右下大方格內的精子進行計數，再求得每個大方格中精子的均數，最后得出小鼠每毫升精液中的精子數。

1.5 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件分析本研究中的數據，計量資料用均數±標準差（）表示，采用t檢驗，計數資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組小鼠的一般情況

三組小鼠在整個實驗期間精神活動狀態無異常，體重均有所增加。三組小鼠體重增長的幅度相比，差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 三組小鼠精子畸形的情況

植物永久性染發劑組小鼠和氧化永久性染發劑組小鼠精子的畸形率均高于對照組小鼠，差異有統計學意義(P＜0.01)。植物永久性染發劑組小鼠與氧化永久性染發劑組小鼠精子的畸形率相比，差異無統計學意義(P＞0.05)。詳情見表1。

表1 三組小鼠精子畸形的情況

2.3 三組小鼠的精子計數

三組小鼠的精子計數相比，差異無統計學意義(P＞0.05)。詳情見表2。

表2 三組小鼠的精子計數（×106/ml，）

表2 三組小鼠的精子計數（×106/ml，）

分組 只數 精子計數植物染發劑組 10 11.62±3.05氧化染發劑組 10 9.21±2.74對照組 10 13.36±5.48

3 討論

近年來，隨著染發劑的廣泛使用，有關染發劑毒性的研究報道逐年增多。有很多專家學者對染發劑致小鼠精子畸形的作用進行了實驗研究。王麗麗等[1]研究發現，用氧化型染發劑對小鼠進行染毒處理會增加其精子的畸形率。吳雨龍等[2]的研究證實，氧化型染發劑對雄性小白鼠的精子具有致畸變的作用。相關的流行病學調查發現，卵巢癌、膀胱癌的發生與患者長期使用染發劑存在一定的關聯性[3]。精子畸形是指精子的形態異常。精子的畸形率與精子計數是反映精液質量的重要指標。精子畸形率的增加與精子計數的減少是雄性小鼠生殖功能受損的重要特征之一。有研究指出，經染發劑染毒處理后的小鼠其精子畸形的主要類型包括胖頭、尾折疊、無鉤、香蕉形、無定形、雙頭及雙尾等[4]。其中尾折疊畸形最為常見，其次為胖頭畸形，而雙頭及雙尾畸形則較為少見[5-6]。本研究的結果顯示，植物永久性染發劑組小鼠和氧化永久性染發劑組小鼠精子的畸形率均高于對照組小鼠，差異有統計學意義(P＜0.01)。

綜上所述，用植物永久性染發劑和氧化永久性染發劑對小鼠進行染毒處理均會增加其精子的畸形率。