《蒲公英多糖鐵的制備及其鐵含量測定》綜合創新實驗設計

樊永嬋，李炳川，李沫瑤，張蓮姬,2

(1 延邊大學理學院化學系，吉林 延吉 133002；2 延邊大學化學國家級實驗教學示范中心，吉林 延吉 133002)

目前各個高校在高年級開設綜合性實驗課程，其目的是培養學生探究精神、創新思維。但現狀不容樂觀，其存在的問題主要有以下幾點：(1)實驗中學生能夠自主設計與探索的部分較少。從實驗原理、實驗步驟到思考與討論，都是預先設定的，學生沒有自主探索的機會。(2)實驗項目內容比較陳舊，不利于激發學生的實驗興趣和積極性。(3)學生很少有綜合運用實驗知識、技能的機會，很容易感知到所掌握的知識和技能是“短截性”的，面對實際課題仍無從下手。因此，有必要設計能避免以上現存問題的創新性綜合實驗，提高學生的創新能力、綜合運用知識的能力及分析問題和解決問題能力等。

多糖鐵配合物(PIC)是一種新型補鐵劑[1]，具有良好的療效、穩定性、生物活性，近幾年許多學者致力研發新型補鐵劑，如當歸多糖鐵、大棗多糖鐵等[2]，但目前將關于多糖鐵的科研成果設計為本科生綜合實驗項目的尚未見報道。

本創新實驗題目來源于一項大學生創新創業科研項目，選用各地區均廣泛存在的蒲公英為材料，制備一種新型口服補鐵劑。實驗內容包括多糖的提取及精制、多糖鐵的制備和鐵含量測定[3]，在整個實驗過程中綜合運用了學生所掌握的基本知識和技能，讓學生感知到學而有用。

本創新實驗設計嘗試將大學生創新創業課題成果與實驗教學相結合[4]，為深化化學實驗教學改革，提高實驗教學中綜合性、創新性，培養高素質專業創新人才提供有效途徑。

1 實 驗

1.1 實驗原理

鐵是維持人體主要代謝功能所必需的生命元素，缺鐵會引起缺鐵性貧血及其他疾病。口服補鐵劑是治療缺鐵性貧血的最有效的方法。傳統補鐵劑如硫酸亞鐵，存在刺激胃腸道和穩定性差的缺點。新型多糖鐵補鐵劑(PIC)，不僅穩定性良好，在體內釋放鐵后，多糖還具有多種生物活性。

蒲公英的花、葉、根中都含有多糖，其中根部多糖含量最高。據報道蒲公英多糖具有抗菌、抗氧化、等生理活性[5]，是優良的多糖的提取材料。多糖易溶于熱水，不溶于乙醇等有機溶劑，因此本實驗采用水提醇沉法提取蒲公英根粗多糖，采用Sevag法除蛋白，獲得蒲公英精多糖；以蒲公英精多糖和氯化鐵為反應物，在堿性條件下制備蒲公英多糖鐵，采用透析法精制。

多糖鐵的結構研究表明，三價鐵(如FeCl3)在堿性條件下由于其內在特性易形成羥基氧化鐵聚合鐵核，然后以聚合鐵核為結構中心，穩定地螯合一層多糖鏈，形成鐵核分子，外部再包裹一層親水性的鞘狀多糖鏈，圖1為多糖鐵結構示意圖。

圖1 多糖鐵結構示意圖

1.2 試劑或材料

氯化鐵、檸檬酸三鈉、鹽酸羥胺、鄰二氮菲、醋酸鈉、無水乙醇、石油醚、硫氰酸鉀，以上試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；蒲公英根，吉林省長白山地區的野生蒲公英根；透析袋(截留分子質量7000 D)，上海源葉生物科技有限公司。

1.3 儀器和表征方法

1.3.1 儀 器

HH-2數顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市科析儀器有限公司；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；80-2臺式離心機，江蘇省金壇市科析儀器有限公司；KQ-300DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；98-1-C型數字控溫電熱套，天津市泰斯特儀器有限公司；RT2基本型加熱攪拌器，上海珂淮儀器有限公司；WD700 LG微波爐，天津樂金電器有限公司。

1.3.2 表征方法

紫外-可見分光光度法。

1.4 實驗步驟/方法

1.4.1 蒲公英多糖的提取及精制

1.4.1.1 脫脂處理

稱取2 g干燥至恒重、粉碎、過60目篩的蒲公英根粉，用回流裝置和石油醚，脫脂處理1 h后，揮干溶劑。

1.4.1.2 粗多糖的提取

本步驟中，引導學生采用粗多糖的提取中常用的普通熱水提取法、微波輔助法、超聲波輔助法進行探索。探索實驗內容如下：

(1)普通熱水提取法：向干燥的蒲公英粉中加60 mL去離子水，80 ℃水浴浸提2 h，過濾，棄渣，取濾液。

(2)微波輔助法：微波分次處理干燥的蒲公英粉2 min (功率為420 W)，加60 mL去離子水，80 ℃水浴浸提2 h，過濾，棄渣，取濾液。

(3)超聲波輔助法：向干燥的蒲公英粉中加60 mL去離子水，超聲振蕩1 h(120 W，60 ℃)，過濾，棄渣，取濾液。

1.4.1.3 粗多糖的精制及得率計算

采用Sevag法除蛋白，具體操作如下：將蒲公英多糖溶液倒入分液漏斗中，加入其體積1/4的Sevag溶液(氯仿:正丁醇體積比為4:1)，劇烈振蕩、靜置，將渾濁的蛋白層從分液漏斗下口放出，重復操作直至沒有渾濁的蛋白層。將多糖液從分液漏斗上口倒入燒杯中，80 ℃加熱濃縮至約其體積1/3，冷卻，加入其體積3倍的無水乙醇，于4 ℃冰箱一夜。離心(3000 rpm，10 min)，取沉淀、干燥，獲得蒲公英精多糖，稱重并計算得率。

1.4.2 蒲公英多糖鐵的制備及精制

1.4.2.1 多糖鐵的制備

采用FeCl3共熱法制備蒲公英多糖鐵，具體操作如下：稱取0.2 g蒲公英精多糖和0.1 g檸檬酸三鈉置于三口燒瓶中，60 ℃加熱溶解。在磁力攪拌條件下緩慢滴加2 mol·L-1的FeCl3和20% NaOH(滴加速度比約1:2)，反應過程中用精密pH試紙檢查反應液的pH，控制pH為8，當出現紅棕色沉淀時立即停止滴加，繼續反應1 h。

本步驟中，引導學生對制備多糖鐵的不同條件如：溫度、pH進行探索。

探索實驗內容如下：

(1)反應溫度分別設定為50、60、70 ℃，其他步驟同上。

(2)反應液pH控制為7、8、9，其他步驟同上。

1.4.2.2 多糖鐵的精制

采用透析法精制。將上一步反應液冷卻后倒入透析袋中，用去離子水透析，約4 h后換水，繼續透析一夜。

1.4.3 蒲公英多糖鐵中鐵含量的測定

1.4.3.1 蒲公英多糖鐵樣品溶液的配制及穩定性實驗

將透析袋中的溶液離心，上清液轉移至100 mL容量瓶中，透析袋用去離子水洗三次，洗液全部加入容量瓶中，定容。取5 mL樣品溶液，加1 mL 10%硫氰酸鉀，觀察溶液是否變為血紅色。

1.4.3.2 最佳吸收波長的確定

準確移取10 μg·mL-1鐵標準溶液5 mL于50 mL容量瓶中，加入1 mL 10% 鹽酸羥胺溶液，搖勻。放置2 min后，加5 mL 0.1 mol·L-1NaAc溶液和2 mL 0.15%鄰二氮菲溶液，定容，顯色30 min。配制10 μg·mL-1多糖鐵溶液，按同樣方法定容，顯色30 min。用1 cm比色皿，以空白試劑為參比液，在400～ 600 nm波長范圍內對兩種溶液進行掃描，確定λmax。

1.4.3.3 繪制鐵標準曲線，計算多糖鐵中的鐵含量

準備7支50 mL容量瓶，1～6號分別加入0.00，2.00，4.00，6.00，8.00，10.00 mL 鐵標準溶液，7號加入5 mL多糖鐵樣品溶液，其后再分別加入鹽酸羥胺溶液，搖勻，放置2 min，再各加入5 mL NaAc溶液和2 mL 鄰二氮菲溶液，定容，顯色30 min，在λmax處，測定各溶液的吸光度A。

2 結果與討論

2.1 多糖的提取

普通熱水提取法是通過擴散作用將多糖從蒲公英根部組織內溶解出來，由于細胞內外達到動態平衡需要較長時間，短時間內多糖不能完全溶出，結合教學時數，將熱水浸提時間確定為2 h，精多糖得率為10.01%。

表1 不同方法提取的精多糖得率

微波輔助法中使用的微波能是一種能量形式[6]，它能使極性物質組成的分子瞬時極化相互碰撞促進反應。在提取時間相同條件下，提取多糖時首先微波處理再熱水提取，得率為11.23%，與熱水浸提相比得率提高11.29%。

超聲波輔助提取法是利用超聲波的空化效應將細胞壁震碎[7]。不僅縮短了提取時間，而且多糖得率為15.22%，比熱水提取法得率提高52.05%。

在此步驟中，還可以引導學生通過文獻的索引，了解其他的多糖提取方法，如酶解法[8]、微波-超聲聯合法等，拓展相關的知識面。

2.2 多糖鐵的制備

表2 不同條件制備的多糖鐵鐵含量

溫度較高時，多糖分子無規則運動速率加快使反應受阻；溫度較低時，多糖與Fe3+絡合速率降低。故選擇60 ℃為最佳反應溫度。

反應液pH對多糖鐵中鐵含量的影響較大。檸檬酸三鈉作為反應的螯合劑[9]，水溶液呈弱堿性。pH為7時，其促絡合能力下降，Fe3+不能與多糖完全結合；pH為9時，多糖的部分結構可能被破壞，同時反應液中離子強度增強，產生的陰離子與多糖分子的活性基團發生競爭作用阻礙配合物的形成[10]。故選擇最佳反應液pH為8。

在此步驟中，設置討論問題：除了本實驗中探索的因素之外，還有哪些因素會影響實驗結果？引導學生掌握確定最佳實驗條件的方法，如單因素試驗、正交試驗、響應面試驗等，進一步拓展學生的知識面。

2.3 多糖鐵中鐵含量測定

2.3.1 繪制鐵標準溶液和多糖鐵溶液的吸收光譜

比較鐵標準溶液和多糖鐵溶液的吸收曲線，確定最佳吸收波長為510 nm。

圖2 鐵標準溶液和多糖鐵溶液的吸收光譜

2.3.2 鐵標準曲線的繪制

圖3 鐵標準曲線

實驗結果表明，在0～2.0 μg·mL-1濃度范圍內，吸光度與濃度線性關系良好。

2.3.3 蒲公英多糖鐵中鐵含量的測定

表3 鐵含量測定結果

根據回歸方程，計算出7號溶液濃度為0.82 μg·mL-1，由稀釋比例可知，樣品溶液的鐵含量為8.2 μg·mL-1。

3 結 語

本綜合創新實驗，實驗內容涵蓋到有機化學、分析化學、無機化學等領域，有助于提高學生綜合運用知識的能力。將科研成果融合到實驗教學中，能夠開拓學生視野，提高實驗興趣。在多糖提取、多糖鐵的制備中增加探索實驗條件的環節，使整個教學過程充滿科學探究的樂趣。通過對實驗結果的分析，激發探究問題、解決問題的積極性。該實驗難度適中、內容充實、現象穩定、重復性好，適用于化學及其相關專業本科生綜合實驗教學。