鹿角壯骨膠囊對膝骨關節炎兔軟骨iNOS 和CollagenⅡ表達的影響

梁子聰王 恒?胡建山胡先運

（1.黔南民族醫學高等專科學校，貴州 都勻 558000；2.貴州中醫藥大學第三附屬醫院，貴州都勻 558000；3.貴州醫科大學天然產物化學重點實驗室，貴州 貴陽 510014）

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種累及膝關節滑膜、軟骨、軟骨下骨及關節周圍組織的慢性退行性病變，引起老年人膝關節疼痛、畸形及功能障礙的常見疾病［1］。誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）與KOA發病關系密切，能誘導產生大量的NO，抑制軟骨細胞分泌細胞外基質和合成Ⅱ型膠原（CollagenⅡ），加速了膝關節的破壞，最終導致KOA 的發生［2-3］。前期研究［4］顯示，鹿角壯骨膠囊能改善KOA 患者的臨床癥狀，獲得較好的效果。本實驗通過建立木瓜蛋白酶誘導兔KOA 模型，觀察鹿角壯骨膠囊對關節軟骨中iNOS 和CollagenⅡ表達的影響，進一步了解其對KOA 的保護作用。

1 材料

1.1 儀器 JA10002 型電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；DDIL-5 型恒溫箱（上海安亭科學儀器廠）；ASP300S 型全封閉式組織脫水機、RM2265 型全自動輪轉式切片機、HI1210 型攤片機、DM750 型光學顯微鏡（德國徠卡公司）。

1.2 藥物與試劑 鹿角壯骨膠囊由黔南州中醫醫院制劑科提供（批號黔藥制2013003，規格0.45 g/粒）、木瓜蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司，G8430）；甲苯胺藍染液（北京雷根生物科技有限公司，DA0059）；封閉液（武漢博士德生物工程有限公司）；iNOS、CollagenⅡ多克隆抗體（北京百奧思科生物醫學技術有限公司，MD4695、MD4781）。通用型SP 試劑盒、DAB 顯色盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，SP-9000，ZLI-9017）；4%多聚甲醛、二甲苯、乙醇、乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）脫鈣液由黔南州人民醫院病理科提供，其余試劑均為國產分析純。

1.3 動物 普通級四月齡日本長耳白兔24 只，雌性，體質量（2.0±0.5）kg，由長沙天勤生物技術有限公司提供，生產許可證號SCXK（湘）2014-0010。適應性飼養1 周，分籠飼養，不限制飲食。

2 方法

2.1 造模 24 只兔隨機分為正常組、模型組、給藥組（鹿角壯骨膠囊），每組8 只。按3.5 mL/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，待完全麻醉后，剪刀于右側膝關節內側附近備皮，顯露皮膚，碘伏、75%酒精棉簽反復消毒。1 mL 注射器抽取提前配制的4%木瓜蛋白酶溶液0.5 mL，微微彎曲膝關節，針尖分別在模型組與給藥組兔內側膝眼進針，回抽確定進入關節腔后，緩慢注射，棉簽輕壓針眼，避免溶液溢出。正常組同法注射等體積滅菌注射用水。各組被動屈伸右側膝關節20 次，促進溶液在關節腔內均勻擴散。間隔3 d 重復1次，共注射3 次。末次注射后，各組兔每天驅趕運動30 min，其余時間籠內自由活動。

2.2 給藥 首次注射后第2 周，給藥組給予鹿角壯骨膠囊藥粉0.3 g/kg（參照成人和實驗動物等效劑量［5］換算而得），稱取體質量的相應劑量，用蒸餾水稀釋成10 mL 后灌胃，1 次/d，連續給藥4周。其他組給予10 mL 蒸餾水灌胃。

2.3 動物取材 末次給藥第2 天，麻醉處死所有實驗動物。切開關節囊，取下膝關節及滑膜組織標本，置于4%多聚甲醛中固定。

2.4 兔膝關節軟骨甲苯胺藍染色 甲苯胺藍染色，將石蠟切片入二甲苯2 次，15 min/次，梯度酒精（100% 1 min，90% 1 min，85% 1 min，75%1 min），自來水沖洗2 min，甲苯胺藍染料浸染15 min，自來水再次沖洗2 min，丙酮分化至軟骨細胞清晰可見，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2.5 國際骨關節炎研究學會骨關節炎軟骨組織病理學評估系統（Osteoarthritis Research Society International Osteoarthritis Cartilage Histopathology Assessment System，OOCHAS）評分 參考文獻［6］方法，在光學顯微鏡下對切片進行OOCHAS 評分，評分標準見表1～3。每個樣本取3 次評分的平均值。

2.6 檢測兔膝關節iNOS 和CollagenⅡ表達 采用免疫組化檢測。石蠟切片經60 ℃烘片1 h，入二甲苯脫蠟2 次，10 min/次、梯度酒精（100% 3 min，90% 3 min，85% 3 min，75% 3 min，蒸餾水3 min，PBS 3 min）。將切片置于 pH=6.0，0.1 mol/L枸櫞酸液修復液中，用微波爐100 火力3 min至微微沸騰，再用50 火力維持7 min，停止加熱后自然冷卻20～30 min。用PBS 漂洗3 次，5 min/次。3% H2O2孵育10 min 以消除內源性過氧化物酶活性。PBS 沖洗3 次，5 min/次。滴加封閉液（5% BSA），在濕盒中室溫30 min。用濾紙擦去封閉液，滴加適宜濃度的一抗置濕盒中4 ℃孵膠封片。光學顯微鏡下進行觀察并攝片保存，每張組織切片在相同部位攝取3 個視野（×400）。運用Image-Pro Plus 6.0 專業圖像分析軟件對圖片進行分析，計算相同面積內相關指標陽性表達的平均光密度值（平均光密度值=光密度值/測量面積）。

表1 OOCHAS-分級Tab.1 OOCHAS-grading

表2 OOCHAS-分期Tab.2 OOCHAS-staging

2.7 統計學分析 采用SPSS 22.0 軟件對數據進行統計分析。采用Shapiro-Wilk 法作正態檢測，Levene 法作方差檢測。計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。等級資料比較采用Ridit 分析。P≤0.05 為差異有統計學意義。育過夜（iNOS 為1∶200，CollagenⅡ為1∶150），再用PBS 沖洗3 次，5 min/次，洗去一抗，用濾紙擦去標本外的PBS。滴加生物素化二抗工作液，室溫置濕盒中孵育20 min，用PBS 沖洗3 次，5 min/次，洗去二抗，用濾紙擦去標本外的PBS。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫置濕盒中孵育20 min，用PBS 沖洗3 次，5 min/次，用濾紙擦去標本外的PBS。DAB 顯色劑顯色，自來水充分沖洗。再進行蘇木素復染，脫水，透明，中性樹

表3 OOCHAS-評分（分）Tab.3 OOCHAS-scoring（scores）

3 結果

3.1 各組兔膝關節鏡下病理觀察及OOCHAS 評分 正常組兔膝關節面完整，軟骨不受累，軟骨基質未見腫脹及纖維化，軟骨細胞正常，排列整齊（圖1A～1B）；模型組兔膝關節軟骨表面糜爛、缺損，病損廣泛，關節面邊緣見骨贅形成，關節面缺損處見纖維組織修復、骨質重建，軟骨細胞、纖維細胞增生（圖1C～1D）；給藥組兔膝關節軟骨表面不連續，部分關節面軟骨出現垂直裂隙，較嚴重者可見糜爛，病損范圍較模型組輕，下2/3 軟骨基質染色變淺，部分見軟骨基質內見囊腫形成，軟骨細胞腫脹、壞死（圖1E～1F）。與正常組比較，模型組OOCHAS 分級和分期的R值、評分總分升高（P＜0.05）；與模型組比較，給藥組OOCHAS 評分總分降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組兔膝關節OOCHAS 評分（，n＝8）Tab.4 Rabbit knee joint OOCHAS scores in various groups（，n＝8）

表4 各組兔膝關節OOCHAS 評分（，n＝8）Tab.4 Rabbit knee joint OOCHAS scores in various groups（，n＝8）

注：與正常組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

圖1 各組兔膝關節軟骨鏡下病理形態觀察（甲苯胺藍染色）Fig.1 Pathological changes of rabbit knee articular cartilage in various groups（toluidine blue staining）

3.2 各組兔膝關節iNOS 和CollagenⅡ表達 與正常組比較，模型組兔膝關節軟骨iNOS 的表達升高，而CollagenⅡ的表達降低（P＜0.05）；與模型組比較，給藥組iNOS 的表達降低，而CollagenⅡ的表達升高（P＜0.05）。見圖2、表5。

表5 各組兔膝關節iNOS 和CollagenⅡ表達（，n＝8）Tab.5 Expressions of iNOS and CollagenⅡin rabbit knee joints of various groups（，n＝8）

表5 各組兔膝關節iNOS 和CollagenⅡ表達（，n＝8）Tab.5 Expressions of iNOS and CollagenⅡin rabbit knee joints of various groups（，n＝8）

注：與正常組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

4 討論

KOA 發病機制十分復雜，目前尚不清楚。但其病理改變包括滑膜細胞增生、慢性炎癥細胞浸潤，均與炎癥因子作用密切相關［7］。一氧化氮合酶分 成3 型，包 括nNOS、eNOS、iNOS，其 中iNOS 與KOA 的發病關系最密切［8］。iNOS 在IL-1等炎癥因子作用下，刺激滑膜細胞分泌PGE2和COX-2，加快關節軟骨的破壞；同時亦可加快滑膜成纖維細胞增殖，導致滑膜組織纖維化［9］。iNOS還可合成大量的 NO，產生氧自由基，促進CollagenⅡ、Ⅲ及基質蛋白多糖、層粘連蛋白等多種基質蛋白的降解，抑制軟骨基質的修復［10］。CollagenⅡ是關節軟骨細胞外基質膠原的主要成分（約占膠原總含有量90%以上），其主要作用是維持軟骨結構及功能的完整性［11］。當軟骨中CollagenⅡ表達減少或網狀結構遭到破壞時，可導致軟骨基質分泌減少及炎癥細胞浸潤，從而改變了軟骨細胞生存的微環境，加速軟骨細胞的凋亡［12］。

圖2 各組兔膝關節iNOS 和CollagenⅡ表達（IHC，×100）Fig.2 Expressions of iNOS and CollagenⅡin rabbit knee joints of various groups（IHC，×100）

OA 屬中醫學中“痹癥”范疇，因此膝骨關節炎可稱膝痹。膝骨關節炎可致膝關節腫脹、畸形，形似白鶴的膝關節，故又可稱為鶴膝風［13］。中醫認為本病因年老體衰、肝腎之氣耗竭，不能濡養肌肉及骨髓，導致肌肉萎縮、關節活動不利而發病［14］。治則為滋補肝腎、強筋壯骨。鹿角壯骨膠囊以鹿角膠為君藥，主歸肝、腎經，起到補腎強骨功效。臣以骨碎補、熟大黃、黃芪、當歸增強君藥補益肝腎之功，佐以血竭、炒土鱉、鍛自然銅、白術、川芎等多味中藥共湊活血通經、緩急止痛之功。鹿角膠、骨碎補、熟地黃等現代藥理學研究［15-16］顯示，鹿角膠含藥血清能顯著促進軟骨細胞CollagenⅡ的表達，促進關節軟骨基質修復；而骨碎總黃酮可降低軟骨中iNOS 的表達，減輕炎癥細胞因子對膝關節的破壞。本實驗結果顯示，與模型組比較，給藥組OOCHAS 評分總分明顯降低（P＜0.05），iNOS 的表達明顯降低而CollagenⅡ的表達明顯升高（P＜0.05），說明鹿角壯骨膠囊可通過降低軟骨中iNOS 的表達，減輕對Ⅱ型膠原的降解作用，從而起到保護膝關節，延緩關節退變的治療效果。

綜上所述，KOA 發病機制復雜，iNOS 的高表達導致的關節軟骨破壞和軟骨基質降解僅是KOA發病的機制之一。雖然鹿角壯骨膠囊在臨床上治療膝骨關節炎獲得良好的療效，但對其治療作用機制了解尚淺，今后仍需進一步探討。