WNK1在結(jié)直腸癌中的表達情況及對預后的影響

劉利佳，吳欣愛，董文杰，李慧霞

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，河南 鄭州 450052)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，和肺癌、乳腺癌一同被列為當前全球的三大惡性腫瘤。2018年全球新發(fā)CRC病例共1 800 977例，占惡性腫瘤發(fā)病總數(shù)的10.2%，發(fā)病率在總?cè)巳褐袃H次于肺癌和乳腺癌，位列第3。死亡861 663例，占惡性腫瘤死亡總數(shù)的9.2%，死亡率在總?cè)巳褐袃H次于肺癌，位列第2[1]。近年來我國CRC發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢[2]。癌胚抗原和糖類抗原是當前CRC臨床診斷中常用的腫瘤標志物，但這些標志物的敏感性和特異性不理想，因此急需尋找新的腫瘤標志物以及評估患者預后較靈敏的指標。WNK1[不含賴氨酸(K)1]是WNK激酶家族的成員之一，是一種位于集合管遠端腎單位的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[3]。WNK1在腫瘤細胞增殖、代謝適應、凋亡逃避、浸潤轉(zhuǎn)移中起重要作用[4]。Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導是發(fā)育的核心，HEK293T細胞中下調(diào)WNK1和WNK2，顯著降低了Wnt信號基因的表達，表明敲除WNK1、WNK2基因降低了HEK293T細胞的活性[5]。Vegf/Vegfr信號通路通過Akt激酶介導的磷酸化和WNK1的激活以及斑馬魚中WNK1的表達調(diào)控血管生成，提高了WNK1促進癌組織中血管生成的可能性[6]。ZHANG等[7]研究發(fā)現(xiàn)，WNK1作為細胞質(zhì)第二信使參與Cl-通道誘導的信號級聯(lián)反應，促進血管增生。根據(jù)以上研究推測，WNK1的表達與腫瘤的侵襲性行為相關。據(jù)報道，WNK1基因的拷貝數(shù)在CRC中是異常的[8]。然而WNK1在CRC中的表達情況以及其對CRC患者的影響尚無報道。本研究探討WNK1在CRC中的表達情況及其對結(jié)直腸癌預后的影響。

1 資料與方法

1.1 患者組織芯片研究樣本為上海生物科技有限公司組織標本庫提供的68例CRC組織。患者手術時間為2006年7月至2007年5月，最后1次隨訪時間為2014年8月。根據(jù)TNM對腫瘤進行臨床病理分期。其中男41例，女27例，中位年齡55歲。每個研究標本均提供癌組織及癌旁組織，癌旁組織距癌1.5 cm。

1.2 免疫化學染色組織樣本按標準程序處理為福爾馬林固定石蠟包埋組織。兩名專業(yè)的病理學家對免疫組化結(jié)果進行復檢。根據(jù)陽性程度將標本分為3個等級：1級(0%～25%陽性)，2級(26%～50%陽性)和3級(51%～100%陽性)。統(tǒng)計分析中1、2級為陰性，3級為陽性。癌組織中WNK1表達陽性38例，陰性30例，癌旁組織中WNK1表達陽性10例，陰性58例。

1.3 細胞系、化學物質(zhì)和抗體本實驗室在體積分數(shù)為10%DMEM液的胎牛血清中保存了兩株CRC細胞株(HCT116和HCT15)。胎牛血清和DMEM細胞培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司。針對WNK1的抗體購自Abclonal公司。粘連蛋白、波形蛋白和肌動蛋白抗體均購自Cell Signaling Technology公司。通過小干擾RNA(siRNA)誘導WNK1基因抑制。WNK1 siRNAs的序列為:上游引物5’-CAAUGSGUCAGAUAUACGAAtt-3’；下游引物5’-UUCGAUAUCUGACUCAUUGtc-3’；轉(zhuǎn)染前24 h將體積分數(shù)為10%DMEM液的胎牛血清中的HCT116和HCT15細胞接種于6孔板中(每2 mL每孔105個細胞)。Lipofectamine 2000 /siRNA的準備是在500 μL不含血清的optiMEM中加入siRNA和5 μL Lipofectamine 2000。轉(zhuǎn)染后的細胞在37 ℃溫度下孵育48 h后進行實驗。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆體通過蛋白免疫印跡法檢測得到驗證。

1.4 蛋白免疫印跡收集細胞樣本，將樣品(20 μg)的細胞裂解物在體積分數(shù)為10%的SDS-PAGE中進行凝膠電泳，然后將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用50 g·L-1的脫脂奶粉和體積分數(shù)為0.1%的Tween20在三倍緩沖鹽水中封閉膜，并用抗體探測，之后使用增強化學發(fā)光法顯影。

1.5 Transwell實驗將細胞濃度為1×105個·mL-1、體積分數(shù)為0.1%胎牛血清的DMEM接種在室板(BD Biosciences)中的Transwell過濾器(8 μm孔徑)的每個小室上部培養(yǎng)嵌室內(nèi)。在底部培養(yǎng)室每室加入1.5 mL體積分數(shù)為20%胎牛血清的DMEM。在37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用棉棒輕輕擦去嵌室底部內(nèi)表面的細胞。用多聚甲醇固定并用Giemsa染色。顯微鏡下隨機選取5個視野, 統(tǒng)計小室細胞的遷移數(shù), 取平均值進行統(tǒng)計分析。

1.6 細胞劃痕實驗以每孔5×105個細胞將對數(shù)期siWNK1細胞及轉(zhuǎn)染空載體對照組細胞接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h。用1 mL槍頭在孔內(nèi)沿直徑方向畫粗細均勻的1條豎線，用PBS洗細胞2次，去除脫落細胞，并將其放入培養(yǎng)箱中，0 h和48 h時在倒置顯微鏡下觀察細胞劃痕的狀態(tài)并拍照。計算劃痕的相對愈合率。公式為：劃痕的相對愈合率=(0 h的劃痕寬度-48 h的劃痕寬度)/ 0 h的劃痕寬度×100%。

2 結(jié)果

2.1 WNK1在CRC及癌旁組織中的表達情況CRC組織WNK1的表達陽性率[(55.9%(38/68)]高于癌旁組織[14.7%(10/68)]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。WNK1的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(均P<0.05)；WNK1表達與年齡、性別、腫瘤直徑和腫瘤浸潤深度無關(均P>0.05)。見表1。

表1 WNK1表達和CRC臨床病理特征的關系(n)

2.2 WNK1表達與CRC患者OS和PFS的關系WNK1高表達CRC患者OS率和PFS率均低于WNK1低表達患者(均P<0.05)。見圖1、2。

圖1 WNK1表達對CRC患者OS的影響

圖2 WNK1表達對CRC患者PFS的影響

2.3WNK1基因?qū)ι掀ぜ毎?間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影響經(jīng)蛋白免疫印跡法證實，WNK1在HCT116和HCT15細胞系中的表達均下調(diào)，HCT116細胞中灰度降低72%，HCT15細胞中灰度降低85%。見圖3。在HCT116和HCT15細胞中，WNK1的下調(diào)可恢復上皮標志物鈣黏附蛋白E的表達，并伴隨間質(zhì)標記物波形蛋白的丟失。見圖4。

圖3 蛋白免疫印跡法檢測確認HCT116和HCT15中瞬時siRNA轉(zhuǎn)染敲低WNK1

圖4 蛋白免疫印跡法檢測WNK1下調(diào)對鈣黏附蛋白E及波形蛋白的影響

2.4WNK1基因?qū)RC細胞遷移能力的影響Transwell結(jié)果顯示，采用siRNA抑制WNK1基因后HCT116細胞中通過濾膜遷移至下室的細胞(57.00±4.36)少于轉(zhuǎn)染空載體對照組(230.00±8.89)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；HCT15細胞中通過濾膜遷移至下室的細胞(61.00±3.61)少于轉(zhuǎn)染空載體對照組(241.00±5.52)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5。劃痕實驗結(jié)果顯示，在HCT116中下調(diào)WNK1基因后細胞48 h劃痕愈合率(10.7%)低于轉(zhuǎn)染空載體對照組(60.3%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在HCT15中下調(diào)WNK1基因后細胞48 h劃痕愈合率(7.8%)低于轉(zhuǎn)染空載體對照組(45.8%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖6。

圖5 Transwell實驗檢測下調(diào)WNK1對HCT116和HCT15細胞遷移能力的影響

圖6 細胞劃痕實驗檢測WNK1對HCT116和HCT15細胞遷移能力的影響

3 討論

CRC由于早期癥狀缺乏或不典型，就診時往往已為進展期腫瘤，且CRC患者生存率與其分期密切相關，Ⅰ期與Ⅳ期患者5年生存率分別為93%和8%[9]。尋找方便靈敏的指標或方法來篩選腫瘤及評估預后是提高CRC患者生存期的有效方法。

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶是一種保持血壓穩(wěn)態(tài)的重要蛋白激酶，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，WNK1激活OSR1信號級聯(lián)是調(diào)控小鼠胚胎發(fā)育過程中血管生成和心臟形成的重要途徑[10]，而新生血管形成在腫瘤性疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。肺癌組織中抑制WNK1可逆轉(zhuǎn)EMT和癌細胞遷移[11]。研究發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌中一種新的WNK1-ROS1融合，對克唑替尼敏感，WNK1-ROS1重排似乎是非小細胞肺癌的一個新的驅(qū)動因素[12]。有證據(jù)表明PDK1/WNK1信號通路與乙肝相關性肝癌有關，p-PDK1和p-WNK1在乙肝相關性肝癌細胞中上調(diào)[13]。Kim等[14]最新研究表明，WNK1通過激活TRPC6促進腎透明細胞癌增殖和遷移，通過激活TRPC6-NFAT通路促進腎腫瘤進展，WNK1是腎透明細胞癌潛在診斷標準物。Costa等[15]在甲狀腺乳頭狀癌中發(fā)現(xiàn)嵌合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物WNK1-B4GALNT3，并與B4GALNT3過表達相關。研究發(fā)現(xiàn)，復發(fā)性卵巢癌細胞中WNK1蛋白水平高于匹配的原發(fā)腫瘤細胞[16]。據(jù)報道，WNK1-OSR1激酶介導的NKCC磷酸化激活促進膠質(zhì)瘤遷移[17-18]。WNK1的下調(diào)降低了前列腺和神經(jīng)干細胞的細胞遷移和侵襲能力[19-20]。此外，Desjardins等[21]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，WNK1-SPAK/OSR1信號通路通過調(diào)節(jié)NKCC1和KCC2參與了大鼠骨腫瘤疼痛的形成，WNK1-SPAK/OSR1信號可能是骨腫瘤疼痛治療的潛在靶點。

本研究發(fā)現(xiàn)，CRC組織中WNK1的表達陽性率高于癌旁組織。此外，WNK1的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關。WNK1高表達CRC患者OS率和PFS率均低于WNK1低表達患者，提示W(wǎng)NK1可能參與了CRC的復發(fā)。為進一步證明WNK1在CRC中的作用，采用蛋白免疫印跡法對細胞的上皮和間質(zhì)標志物進行分析，發(fā)現(xiàn)在體外抑制WNK1基因可抑制EMT。Transwell分析與劃痕實驗證實了在體外抑制WNK1基因可抑制CRC細胞的遷移能力。

WNK1在CRC中的表達顯著高于正常結(jié)直腸組織，且WNK1高表達與CRC TNM分期及復發(fā)轉(zhuǎn)移相關。抑制WNK1基因可抑制EMT和CRC細胞的遷移能力。因此，WNK1基因的表達水平可能成為評估CRC預后的重要指標和潛在的治療靶點，但具體調(diào)控機制有待進一步研究。