豬冷凍精液生產技術標準與規范及相關問題解讀

張樹山，張德福*，韓雪峻，姜紅菊

（1.上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106；2.上海市農業遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海 201106；3.上海祥欣畜禽有限公司/上海種豬工程技術研究中心，上海 2013021）

1 背景

優秀種公豬在豬育種和生豬商品化生產中的作用至關重要，而豬冷凍精液保存技術正是讓其實現種用價值倍增的有效手段之一。然而，與牛精液相比，豬精液量大、精子對“冷休克”較敏感等特性，多年來一直制約著豬精液冷凍保存技術的發展。此外，作為多胎家畜，豬冷凍精液使用效果的評價指標除受胎率外還有窩產仔數，這也是豬冷凍精液推廣應用難度較大的原因。近10年來，研究者們已摸索出一套針對豬精液和精子特性的冷凍工藝，在冷凍稀釋液研發方面也取得了較大進展；可精準控制降溫的精子冷凍儀、豬精液自動分裝等儀器的問世和應用，結合母豬深部輸精技術等，使豬冷凍精液的商業化生產和應用成為可能。

自2009年起，隨著全國性的豬遺傳改良計劃的全面實施，政府通過國家生豬良種補貼項目加強國家生豬核心育種場、種公豬站建設，有力地推動了國內育種和生產企業單位從種公豬的活體引種，向根據自身需求訂制種豬精液（液態保存和冷凍精液）轉變。近兩年非洲豬瘟疫情的慘痛教訓，使業內人士開始意識到，與引進種公豬和訂制液態保存精液相比，豬冷凍精液可使種公豬遺傳資源突破時空限制，并具有更高的生物安全性。目前，國內多家知名豬育種企業十分重視冷凍精液商業化生產和銷售，市場前景十分看好。

“不以規矩，不成方圓”，出自《孟子》。技術標準/規范是一種規定產品、過程或服務應滿足技術要求的文件，一般認為規范的強制性弱于標準。技術標準的制訂已經成為產業特別是高技術產業競爭的制高點。當今知識經濟時代，在一些高技術產業領域已由過去的“先有產品后有標準”向“標準先行”轉變。在家畜冷凍精液中，牛冷凍精液是最早實現商業化生產和銷售的，我國至今已有4個國家和地方標準。豬冷凍精液標準化的商業生產也應有生產標準來規范，但目前能公開檢索到的相關生產技術標準僅有一個（DB13/T 2633-2017 豬冷凍精液，河北省）。文章對公開發表和正在修訂的2個豬冷凍精液生產標準/規范（種豬冷凍精液，國家標準，修訂中；豬冷凍精液生產技術規范，上海市，修訂中）逐條進行解讀和探討，以期為相關管理和生產人員能更好地學習和理解生產標準，從而推動豬冷凍精液的商業化進程。同時，標準修訂者也能從生產一線人員及時得到反饋意見，以便進一步提高標準的先進性、科學性、合理性和可操作性。

2 豬凍精制作標準與規范要點梳理與解讀

2.1 使用范圍

文章涉及的3個標準/規范主要針對種豬冷凍精液的商業化生產，不適合用于地方豬品種遺傳資源保存。

我國地方豬品種群體規模較小、甚至部分品種瀕臨滅絕，少量的公豬顯得尤為珍貴，故地方豬品種保種對公豬個體、細管冷凍精液密度、解凍精液品質（活力、頂體完整性等）等指標遠低于商業化凍精的生產。

2.2 相關術語（豬精液品質檢測指標）

豬精液品質檢測指標及相關術語如表1。

序號為1～3的指標均可以利用計算機輔助分析（Computer aided sperm analyse，CASA）系統進行檢測。該系統能通過跟蹤精子運動軌跡測定精子運動速率，并自動分析精子活力和活率指標；精子畸形率則由計算機自動識別精子再由人工評定分類，最后分析畸形精子百分率（畸形精子包括頭部、體部和尾部畸形或缺失等）。

精子活力和活率這兩個指標主要用于評價精子運動性能，二者僅有一字之差，容易混淆。目前，業內人士已約定俗成，精子活力指直線運動精子百分率；精子活率指活精子百分率，可以由CASA系統分析（通過判斷精子運動情況）或染色方法鑒定。

高品質的豬冷凍精液，意味著解凍后精子具有較好的運動性能（評價指標為精子活力）和頂體完整性。精子活力較高的解凍精液，能夠使部分精子到達受精部位；到達受精部位的精子還需要有較完整的頂體才有較好的穿卵能力（即受精能力）。故精子頂體完整性是評價解凍精子受精能力的一個重要指標。通常采用FITC-PNA染色法在熒光顯微鏡下分析。

2.3 種公豬和原精液要求

種豬來源于具有較好的種用價值，體型外貌和生產性能等符合種用要求、三代系譜資料齊全、體質健康，不患有國家或農業農村部已發布的動物防疫法中所明確的二類疾病的種豬。

由于豬精子耐凍性具有較明顯的個體差異性，通過豬精子耐凍性試驗篩選（即對所有公豬精液進行冷凍，通過檢測其解凍活力、頂體完整性和畸形率等指標評定）的公豬用于制作豬冷凍精液，具有高育種價值的種公豬可降低篩選標準（如解凍后精子活力、精子畸形率和頂體完整性）。

原精液色澤為灰白色或乳白色，精子活力≥70 %，精子密度≥2.0h108個/mL，精子畸形率≤5 %。

表1 相關術語和豬精液品質檢測指標

2.4 豬冷凍精液質量要求

表2為種豬冷凍精液質量要求。

解凍后的冷凍細管上的標記應該清晰易識別、信息齊全，與小布袋或貯精管上標記一致。將豬解凍精液推入解凍液后，將排空細管與解凍精液一一對應、整齊擺放，以便后面信息記錄。

如果解凍過程中有水進入解凍精液，會對精子產生滲透壓損傷，故解凍時發現細管有破損應即棄掉。

豬冷凍精液劑型主要有0.5、1.0和5.0 mL細管三種。普遍認為，細管劑型越大（即體積越大），細管內不同部位豬精液冷凍降溫和解凍升溫速率較低且差異越大，精子的冷凍效果不如小劑型。其優點是體積大、有效精子數多，解凍效率相對較高。目前，在豬冷凍精液商業化生產的精液灌裝、封口等自動化生產設備絕大多數是生產0.5 mL劑型的。但0.5 mL劑型的問題是單根細管內有效精子數相對較少，解凍較繁瑣（每頭母豬單次輸精需解凍0.5 mL細管冷凍精液4～8支）。

精子活力，指豬解凍精液在水浴鍋靜置20 min后，利用CASA系統進行分析，取三次檢測均值（允許誤差不能大于均值的5%）。

前向運動精子數（即有效精子數目）=細管體積h精液密度h精子活力。

精子畸形率采用姬姆薩染色法，在顯微鏡（400～600倍）下觀察，并用血球分離計數器計數，每個抹片觀察200個以上的精子（分左、右2個區），取2抹片的平均值（變異系數不得大于20%）。

精子頂體完整率采用FITCPNA熒光染色后，在400h熒光顯微鏡下（激發波長480 nm、發射波長530 nm紫外光）觀察并計數200個以上精子，并統計頂體完整精子數量并計算百分率（重復2次，允許誤差不能大于均值的5%）。

細菌含量是家畜冷凍精液的一個重要品質指標，對豬冷凍精液的使用效果和母豬生殖系統的健康均有重要影響作用。采用公豬自動采精系統、保持豬冷凍精液生產場地清潔、加強器皿和稀釋液滅菌等均可明顯降低豬冷凍精液中的細菌含量。豬冷凍精液細菌含量檢測，通過對豬解凍精液接菌、培養和細菌菌落計數，1 mL豬解凍精液中細菌菌落數量≤1 000個為合格產品。隨著豬精液冷凍技術的進步，未來的標準修訂會逐步提高精液中的細菌含量標準。

非洲豬瘟病毒、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、高致病性豬藍耳病病毒、豬圓環病毒、豬細小病毒和布魯氏菌等7種病毒相關國家/行業標準，采用試劑盒的方法檢測（也可采用采精種公豬個體定期檢測結果），病原學檢測均為陰性即合格。

上述指標在每批次產品入庫前和銷售前各檢測一次（或每隔半年一次）。

2.5 取樣

2.5.1 生產方取樣

按照GB/T 2828.2，采用極限質量LQ=8.0，模式A一次抽樣方案，確定取樣種豬樣品量。

采用極限質量LQ=8.0，如表3所示，細管冷凍精液數量在151～280支時，抽檢28支全部達標即為合格產品；數量在3 201～10 000支時，抽檢125支，不達標數量≤5時為合格產品。

2.5.2 質量監督取樣

按照GB/T 2828.11，該群體種豬為一監督總體，采用聲稱質量水平（DQL）=10，選用第Ⅰ檢驗水平的抽樣方案，確定取樣種豬樣品量（見表4）。

表2 種豬冷凍精液質量要求

聲稱質量水平（DQL）=10，若細管冷凍精液數量在90～100支之間時，取樣數量為4支；若細管冷凍精液數量在150～170支之間時，取樣數量為7支。

2.6 豬冷凍精液細管的包裝和貯存

包裝應在液氮或-140℃以下的環境中進行。將檢驗合格的冷凍細管采用手工或半自動儀器裝入貯精管，包裝后的細管冷凍精液，其棉塞端應朝向貯精管的底部。再將裝有豬冷凍精液細管的貯精管移至滅菌紗布袋（一般每個紗布袋裝同1頭公豬的冷凍精液細管），同一天的多個紗布袋的封口繩分別拉緊、用另外一根繩扎在一起后浸入液氮中，棉繩上端貼好標簽拴到液氮罐提手處（圖1、圖2左，即“貯精管 紗布袋 細繩”法）。采用“貯精管 紗布袋 細繩”法的缺點是，不同紗布袋的系繩容易纏到一起不容易取出。種豬冷凍精液應貯存于裝有液氮的容器。在由一個容器轉移至另一容器時，在空氣中的滯留時間不得超過3 s。

國外也有采用“貯精管 貯精筒 提漏”方法的情況，即將裝滿冷凍細管的貯精管收集至大號貯精筒、移至敞口液氮罐中的提漏中保存（圖2右）。這種保存方法取放、解凍方便，值得有條件的生產企業借鑒。

保存豬冷凍精液的液氮罐由專人負責維護和液氮添加，并做好液氮添加記錄。

豬冷凍精液信息標記主要在冷凍細管封口一端（使用細管打印機）、紗布袋上和液氮罐口系繩末端（見圖3。使用記號筆標記、粘貼打印標簽或二維碼）。液氮罐邊放置豬冷凍精液記錄本，記錄生產日期、生產者與質檢員姓名、生產廠家地址與聯系方式、公豬號、液氮罐標號、冷凍細管數量，移出和移入均有記錄，并將記錄輸入電子數據庫。

2.7 豬冷凍精液的運輸

運輸過程中貯存容器不得碰撞或劇烈震動。液氮罐外的明顯位置標記“向上”、“小心輕放”等儲運圖示標志；搬運、裝車時應該注意罐體防護，不得傾斜、橫倒、碰撞和強烈振動，確保豬冷凍精液始終浸泡在液氮中；隨罐附帶記錄一份并將電子版發給客戶。

表3 模式A 一次抽樣方案（主表）

表4 第Ⅰ檢驗水平的抽樣方案表（L=1）

圖1 放置冷凍細管的貯精管（左），用記號筆標明簡單信息；帶有系繩的紗布袋（右）

圖2 國內使用的“貯精管—紗布袋—細繩”法（左）和國外使用“貯精管—貯精筒—提漏”法保存細管冷凍精液（右）

圖3 有打印信息的細管（左）；紗布袋系繩末端有彩色打印的標簽，有生產日期、豬耳號等信息（右）

3 展望

豬冷凍精液是繼牛冷凍精液之后第二個實現商業化生產和銷售的家畜精液品種，規模化、商業化的生產迫切需要相關標準來規范。文章解讀的3個標準/規范均是由科研院所和生產企業聯合制定，并廣泛征求意見和修改，具有較高的先進性、科學性、合理性和可行性。隨著豬冷凍精液相關標準相繼頒布，必將發揮引領和帶動作用，從而推動“豬冷凍精液商業化生產 銷售 技術服務”這一體系健康、飛速發展。同時，相關標準也需要從科研活動、生產、使用等環節不斷得到反饋、修訂，尤其要注意借鑒歐盟、美國等畜牧業發達國家的先進經驗。