復合益生菌乳膏劑的制備和對斷奶仔豬生長性能的影響

魏秀蓮，張 樂，婁迎霞，吳長金，曹 林，張 靜，陳小全，劉雪連

（1.北京市飼料監察所，北京 100107；2.飼用微生物工程國家重點實驗室，北京 100192；3.浙江大北農農牧科技有限公司，浙江 321016；4.哈爾濱大北農牧業科技有限公司，黑龍江 哈爾濱 150431）

1 簡介

畜禽養殖中抗生素的濫用導致嚴重的細菌耐藥性，世界各國陸續禁止抗生素作為促生長添加劑的使用。近年來，生豬生產中，已廣泛使用益生菌來替代抗生素，提高豬的生產性能[1]。使用益生菌可改善豬只腸道菌群結構、抑制有害菌定殖，預防豬只消化道疾病[2]。

已有多項研究探討單一菌株對斷奶仔豬生產性能的影響，包括約氏桿菌和干酪乳桿菌等[3-4]。當前，人們對于益生菌飼料添加劑的研究正從單一菌株向復合菌株轉變[5-6]。因此，根據哺乳仔豬階段營養物質的需求，基于前期工作基礎，選擇了干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）， 屎 腸 球 菌（Enterococcus faecium），植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）組合成不同配方，將其添加到乳膏劑基質中，制備了4種復合益生菌乳膏劑，測試其在常溫下的保存穩定性，并將優化配方作為飼料添加劑添加到斷奶仔豬日糧中，評估其對斷奶仔豬生長性能的影響，包括平均日增重、平均日采食量、飼料增重比和末均重，以及腹瀉率。

2 材料和方法

2.1 復合益生菌乳膏劑的制備

參考北京大北農科技集團股份有限公司企業標準《哺乳仔豬用0.2%復合預混合飼料（源生態軟酪乳乳膏劑）》（Q/HDDBN0077-2019）制備乳膏劑基質。以1 000 g乳膏劑基質為例，將濃縮低蛋白乳清粉（430 g）、玉米淀粉（210 g）、蔗糖脂肪酸酯（20 g）、黃原膠（2 g）、殼寡糖（0.5 g）和去離子水混合均勻（338 g），70 ℃巴氏滅菌30 min，使用乳化機以10 000 r/min高速乳化10 min。

將干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），屎腸球菌（Enterococcus faecium），植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii） 4 株菌進行組合，確定如下4個配方，配方1：干酪乳桿菌+屎腸球菌+約氏乳桿菌；配方2：干酪乳桿菌+屎腸球菌+植物乳桿菌；配方3：干酪乳桿菌+屎腸球菌；配方4：干酪乳桿菌+屎腸球菌+植物乳桿菌+約氏乳桿菌。將菌粉組合配制，加入到乳化好的乳膏劑基質中，初始活菌數約為109CFU/g乳膏劑。

2.2 復合益生菌乳膏劑的穩定性評估

將所制備的4種配方的復合益生菌乳膏劑，在室溫下儲存56 d，在 0、7、14、21、28、35、42、49和56 d分別進行活菌計數。具體方法為：取乳膏劑樣品10 g，加入無菌玻璃珠10～15顆，無菌水100 mL，室溫下180 r/min震蕩混勻10 min，梯度稀釋至10-6、10-7、10-8和10-94個濃度，取稀釋液1 mL接種于MRS培養基中，涂布計數，每個濃度做3個平行。同時使用pH計測定乳膏劑的pH（梅特勒-托利多，FE20）。

2.3 復合益生菌對斷奶仔豬生長性能的影響

2.3.1 動物選擇與試驗設計

從母豬胎次一致、產期相同的20窩中選取體重相似、健康狀況良好的14日齡杜h長h大三元雜健康斷奶仔豬80頭，按照窩別和體重隨機分成2個組（復合菌乳膏劑組、對照組），每個組4個重復，每個重復10頭豬，試驗進行28 d。試驗日糧參照NRC（2012）體重5～7 kg仔豬營養需要飼喂基礎日糧，復合菌乳膏劑組每頭豬添加2 g乳膏劑，對照組僅飼喂基礎日糧。

2.3.2 飼養管理

試驗豬飼養于玉田豬場溫控仔豬舍中，早、中、晚各加一次料，觀察各欄仔豬采食量，保證不同采食量的仔豬都能完全自由采食和飲水。

2.3.3 指標測定

1）平均日增重（Average daily gain，ADG）。試驗豬在試驗開始、第15天、第29天時，早晨8：00空腹稱重（前一天20：00斷料），ADG（kg）=[末欄重（kg）-始欄重（kg）] / [每欄仔豬頭數h 飼養天數（d）]。

2）日采食量（Average Daily Feed Intake，ADFI）。以欄為單位記錄每天的投料量與剩料量，求出試驗期間每欄總的投料量與剩料量，ADFI（kg）=[投料量（kg）-剩料量（kg）] / [每欄仔豬頭數h 飼養天數（d）]。

3）飼料轉化率（增重比）（Feed to Gain Ratio，F/G）。F/G=ADFI（kg）/ADG（kg）。

4）腹瀉率（Diarrhea Rate，DR）：每天記錄每個重復中腹瀉的豬只數，求出該重復的總腹瀉頭次數，將其除以該重復的總飼養頭次數，即得出該重復的腹瀉率。最后算出該處理各重復腹瀉率的平均值。腹瀉的標準是，糞便不形成穩定固體，仔豬有明顯的稀便肛尾粘著現象。DR（%） = [每欄總腹瀉頭日次數/（每欄仔豬頭數h 飼養天數（d））]h100%。

2.4 數據統計分析

數據用平均值f標準偏差的方式表示。采用SAS 8.0程序GLM過程進行統計分析，兩組間比較用t檢驗（Student's t test），多重比較用鄧肯法（Duncan test），以P＜0.05為顯著水平。

3 結果

3.1 復合益生菌乳膏劑的穩定性

所制備的4種配方的復合益生菌乳膏劑基質相同，所含菌株種類不同，在室溫下的貯藏穩定性見圖1。由圖1A可見，由干酪乳桿菌、屎腸球菌和約氏乳桿菌組合制備的配方1穩定性最好，在室溫下儲存56 d仍能維持較高的活菌數（＞108cfu/g），而其他配方的活菌數在28 d后開始迅速下降。圖1B為乳膏劑的pH變化，配方1的pH在最初的7 d內下降，隨后保持不變，在56 d的保存期中，4個配方乳膏劑的pH均有所下降，其中配方1的pH變化相對較少。因此，選取配方1復合益生菌乳膏劑用于后續仔豬生長性能評估。

3.2 復合益生菌乳膏劑對斷奶仔豬生長性能的影響

日糧中添加復合益生菌乳膏劑組中，早期斷奶仔豬末均重為(18.22f0.67)kg/頭，顯著高于對照組的(17.12f0.64)kg/頭（P=0.026）。復合益生菌乳膏劑組所得的平均日增重ADG為(485f30)g/頭，顯著高于對照組的 (432f28)g/頭（P=0.019）。2組間平均日采食量ADFI沒有顯著差異（P＞0.05）。計算所得的復合益生菌乳膏劑組和對照組的飼料增重比F/G分別為1.48f0.08和1.69f0.13，飼喂復合益生菌乳膏劑組的飼料增重比低于對照組，結果具有顯著性（P=0.004）。飼喂復合益生菌乳膏劑組和對照組的腹瀉率DR分別為1.09 %和0.69 %。在試驗過程中，飼喂復合益生菌乳膏劑組出現了黃色的不成型的糞便，相對比較黏稠，一定程度上干擾腹瀉情況的判斷。

圖1 4種配方復合益生菌乳膏劑在常溫下儲存0～56 d時的活菌數（A）和pH（B）。

表1 復合益生菌乳膏劑對早期斷奶仔豬生產性能的影響

4 討論

早期斷奶仔豬因其日糧和飼養環境的變化，易產生應激反應，包括腹瀉和死亡等，因此需從調控營養、建立健康腸道菌群等多方面對斷奶仔豬進行保健[7]。目前，已有多項研究證實，給斷奶仔豬飼喂益生菌可提高仔豬腸道健康，增加免疫力及機體的抵抗能力，促進其自身健康生長[3-6]。朱原等綜述了益生菌在建立仔豬健康腸道環境中的作用，主要通過病原抑制、改善腸上皮屏障功能、提高免疫力、調節腸道微生物組成和生成短鏈脂肪酸等途徑[1-2]。

已有多項研究探索了單一菌株對斷奶仔豬生長性能的影響，發現干酪乳桿菌可降低仔豬腹瀉率，并提高其抗氧化能力，但其對平均日增重、平均日采食量和料重比沒有影響[4]。另外，在飼料中添加約氏桿菌可顯著改善斷奶仔豬耗料增重比，并提高其肝臟指數，同時，病理觀察結果顯示添加約氏桿菌對斷奶仔豬的各組織均無不良影響[3]。多種菌株通過不同途徑改善仔豬生長性能。

近年來，復合益生菌的使用日益頻繁，多菌株協同作用效果往往超過單一菌株。張德曉等使用凝結芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌制備復合菌制劑，其可改善仔豬29～60日齡平均日采食量、平均日增重和料重比，但結果并不顯著[5]。楊玲等探討飼糧中添加含丁酸梭菌的復合益生菌對斷奶仔豬飼糧中的抗生素替代效果，分別用含丁酸梭菌的復合益生菌替代0%、50%和100%的抗生素。觀察到替代100%抗生素時可實現其生長性能與抗生素組效果相當，而且能降低腹瀉率[8]。曾秀玲等研究了枯草芽胞桿菌、酵母菌和乳酸菌三者組合的復合益生菌對早期斷奶仔豬生長性能和體液免疫水平的影響，觀察到飼喂益生菌的仔豬日增重增加，體液免疫功能提升，且腹瀉率顯著降低[9]。祝永才報道了使用釀酒酵母菌-枯草芽孢桿菌復合益生菌可有效提高斷奶仔豬的生長性能，在基礎日糧中添加0.30%復合益生菌，可顯著提高試驗組末重、平均日增重和平均日采食量[10]。與之前報道一致，此次研究中，飼喂由干酪乳桿菌、屎腸球菌和約氏乳桿菌制備的復合菌乳膏劑的斷奶仔豬日增重、飼料增重比和末均重均顯著優于對照組。新采用的乳膏劑劑型可提高益生菌存活率，從而提高益生菌的作用效果。同時，我們還觀察到飼喂復合菌乳膏劑的仔豬腹瀉率略微升高，這可能是由于試驗中部分仔豬出現了糞便不成型的情況，因此干擾了腹瀉的判斷和統計。之前有研究報道，在基礎日糧中添加0.20%復合益生菌，其腹瀉率顯著高于添加0.30%復合益生菌[10]，因此，可考慮繼續優化乳膏劑中活菌數來改善這一問題。

目前，大多數關于復合益生菌的研究集中在菌株類型，此次研究首次改善了益生菌飼喂制劑的劑型，用乳膏型替代液體[6]和固態粉[3,4]等兩種傳統劑型。對于液態菌制劑，往往需要在低溫下保存，方可保持菌活性；而固態菌制劑溶解性差，生產成本高，在凍干制備過程中會影響菌活性。在此次的研究結果中，將4種常用復合菌進行組合，經過優化的益生菌乳膏劑活性成分為干酪乳桿菌、屎腸球菌[11]和約氏乳桿菌，由這3種菌組合成的復合菌制劑在常溫下保存56 d仍可保持活菌數高于108cfu/g，在方便儲存和使用的同時，仍可保證益生菌制劑的效果。

5 結論

此次研究中，使用干酪乳桿菌、屎腸球菌和約氏乳桿菌制備了復合益生菌乳膏劑，在室溫下可穩定保存超過1個月，在斷奶仔豬中使用可有效提高平均日增重和末均重、降低飼料增重比，從而提高其生長性能，在仔豬保健中可發揮有效作用。