豬偽狂犬病毒PCR檢測方法的優化

王豕辰，孫 彤，董 恒，侯曉林

（北京農學院動物科學技術學院，北京 102206）

豬偽狂犬病是一種皰疹病毒性疾病，是導致豬繁殖失敗并給養豬業帶來巨大經濟損失的主要病原體之一[1]。其特征在于妊娠母豬流產，公豬不育等。豬偽狂犬病不易與豬瘟、細小病毒感染等病區別開，需要實驗室檢查確診[2]。核酸研究方法在許多領域都得到了廣泛的應用，為了提高PCR的檢測準確度，實驗對PCR擴增條件進行了優化并且檢測了特異性。

1 材料與方法

1.1 材料

豬腎細胞PV-15為實驗室保存細胞株；偽狂犬病毒（PRV）、豬細小病毒（PPV）、豬圓環病毒Ⅰ型（PCV1）和豬圓環病毒Ⅱ型（PCV2）均為實驗室保存毒株；DMEM高糖培養基（DMEM）、胎牛血清(FBS)；青鏈霉素和0.25%胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國HyClone公司；病毒基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR反應試劑盒購自上海生工生物（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及擴毒

調整PV-15細胞個數為1h106個/mL接種于25 cm2細胞培養瓶中，放入37 ℃、5%CO2培養12 h，待細胞長成單層后，吸棄培養基，PBS清洗2次，每次1 min，接毒量為10TCID50，放入37 ℃、5%CO2培養1 h，吸棄病毒，PBS清洗兩次，每次1 min，加入含3%血清的培養基，放入37 ℃、5%CO2培養48 h，終止培養。采用反復凍融法破裂細胞，-20 ℃反復凍融3次后，將細胞瓶內液體全部轉移到15 mL離心管中于600 g離心5 min，收集上清（病毒液），置于-80 ℃保存。

1.2.2 病毒DNA提取

此過程根據試劑盒提供說明書進行操作。向干凈的1.5 mL離心管中加入20μL Prteinase K然后加入200μL病毒液，再加入200μL Carrier RNA工作液（緩沖溶液GB:Carrier RNA=1 100:31比例配置）。蓋緊管蓋置于渦旋振蕩機上震蕩15 s使管內溶液充分混合。將離心管置于56 ℃恒溫水浴鍋中孵育15 min后短暫離心15 s。向管中加入250μL無水乙醇，渦旋振蕩機上震蕩15 s，然后靜置5 min后短暫離心15 s。將離心管中所有液體全部轉移至RNase-Free吸附柱CR2上后，6 000 g離心1 min。500μL溶液GD洗滌一次，然后600μL溶液PW洗滌2次，洗滌離心條件同上。洗滌后向管中加入500μL乙醇，13 000 g離心3 min，然后小心打開吸附柱的蓋子，室溫放置1 min，使吸附膜的完全變干后，加入100μL RNase-Free ddH2O，蓋緊管蓋，靜置5 min后，13 000 g離心1 min，收集洗脫液（含有病毒DNA），-80 ℃保存。

1.2.3 引物的設計與合成

偽狂犬病毒引物使用根據國標方法，擴增偽狂犬病毒基因中434-651堿基對（bp）之間217bp基因片段，由生工生物（上海）股份有限公司合成，其序列為：

P1：5?-CAGGAGGACGAGC TGGGGCT-3’；

P2：5?-GTCCACGCCCCGCT TGAAGCT-3’。

1.2.4 PCR條件的優化

此過程根據試劑盒提供說明書進行操作，實驗室PCR反應采用25μL反應體系，加入PCR MIX 2.5μL，FORWARD PRIMER(10 mmol/L) 12.5μL，REVERSE PRIMER(10 mmol/l)0.1μL，DNA 模 板 0.1μL，ddH2O添加至25μL。調整擴增各參數進行反應條件優化。

1.2.5 PCR特異性試驗

利用優化后的條件對PRV、PPV、PCV1和PCV2分 別 進 行PCR擴增，以鑒定其特異性。

1.2.6 PCR產物檢測

通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增反應產物。電泳緩沖液為1xTAE，電壓為220 V，反應時間為35 min。電泳反應結束后，立即使用凝膠成像系統對實驗品進行照相記錄并分析擴增產物帶。

2 結果

2.1 PRV PCR反應條件優化結果

經過對擴增各參數多次進行優化，結果如圖1所示，當退火溫度為62.5 ℃至63.5 ℃時，在217 bp處出現明細的擴增片段，且無雜帶，擴增效果最佳。94 ℃ 3 min變性，94 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環；72 ℃ 5 min。

2.2 PRV PCR特異性結果

采用優化過的PCR方法對PRV、PPV、PCV1和PCV2分別進行PCR擴增，結果如圖2所示，只有PRV在217bp處出現擴增片段，而PPV、PCV1和PCV2均未出現擴增片段。

圖1 不同擴增參數對PRV PCR的影響

圖2 PRV PCR特異性檢測電泳圖

3 討論

近年來，病毒性疾病已成為現代養豬業發展的主要威脅。尤其是由PRV等引起的呼吸和生殖系統疾病越來越普遍，給養豬業帶來了巨大的經濟損失[3]。由于發病豬臨床癥狀與豬細小病毒，豬瘟病毒等感染相似，所以必須進行實驗室檢測后才可以確診[4]。因此建立一個特異檢測PRV的方法是十分必要的。

在實踐中，PCR可能由于各種原因而失敗，其中引物的非特異性結合是比較常見的[5]。因此，已經開發出許多技術和程序來優化PCR條件。退火是PCR中關鍵的一步，是引物與DNA鏈的結合。退火的溫度對PCR的特異性有巨大影響[6]。退火的溫度需要從多方面去決定，一般是根據引物的最適溫度（Tm）值來設計溫度以便保證擴增效果達到理想[7]。此實驗中根據引物Tm值選擇了16個退火溫度，通過電泳檢測到當退火溫度介于62.5 ℃至63.5 ℃之間時，目的基因片段擴增明顯且沒有雜帶，并且通過特異性檢測證實該反應條件下，只有PRV目的基因可以擴增，PPV、PCV1和PCV2均呈現陰性。

總之，PCR是快速、特異的檢測PRV感染的技術，實驗所優化方法可以為今后實驗室檢測PRV提供一種新的參考。