母豬卵泡發育同步化調控技術研究及應用

秦玉圣，白佳樺，田見暉，馮 濤，宋玉清，肖霖力，黃 正，翁士喬，劉 彥*

(1.北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京 100097；2.中國農業大學動物科技學院，北京 100193；3.北京菲繁生物技術有限公司，北京 100142；4.寧波三生生物科技有限公司，浙江 寧波，315105）

生豬產業是我國畜牧業的重要支柱，我國不僅是世界上最大的豬肉生產國，同時也是最大的豬肉消費國。自2018年8月國內首次出現非洲豬瘟疫情后，其大面積迅速暴發，導致我國能繁母豬存欄急劇下降，對生豬產業經濟造成巨大損失。但通過此次疫情，國內的生豬生產理念正在得到根本轉變，生物安全防控意識得到空前提高，基于母豬定時輸精技術的批次化全進全出生產管理模式得到行業人員的更多關注。母豬定時輸精技術的實現前提是豬群發情周期同步化、卵泡發育同步化、排卵同步化和配種同步化，也就是既要發情周期的同步又要卵泡發育及排卵的同步。文章就母豬卵泡發育的同步化技術及其在定時輸精中的應用進行簡要介紹。

1 發情周期同步化

欲母豬卵泡發育同步化，首先需要確保其發情周期同步。經產母豬哺乳期間，由于仔豬吮吸乳頭刺激促乳素的分泌，負反饋抑制促性腺激素釋放激素（GnRH）的釋放，使母豬卵泡靜止不發育，統一斷奶后，由于同時解除了對GnRH的抑制，經產母豬發情周期也達到同步化。同樣，通過激素制劑調控也可實現母豬發情周期的同步化，例如對處在不同發情周期的后備母豬，通過連續14～18 d飼喂15～20 mg/d烯丙孕素的措施，能有效阻止卵泡發育，當停喂烯丙孕素后，后備母豬群可實現發情周期的同步化。

2 卵泡發育同步化

經上述發情周期同步處理，依然存在母豬發情的個體差異較大，以及靜立發情、排卵較分散的問題，無法實現定時輸精，原因在于母豬卵泡發育尚未達到同步。

2.1 母豬卵泡發育尚未達到同步的原因

1）母豬斷奶后卵泡會呈現多種發育狀態。由于母豬個體差異比較明顯，卵泡發育速度千差萬別（圖1）。有的母豬斷奶時卵泡直徑較大，但在隨后的發育過程中生長速率卻相對較慢，從而在正常時間區間內發情。另有部分母豬斷奶時的卵泡直徑較大，但正在發生閉鎖，斷奶發情需要啟動新的卵泡波，因此，斷奶發情間隔變長，其發情時間晚于斷奶時卵泡較小的母豬。此外，還有一些母豬斷奶時直徑為5～6 mm的卵泡受到促黃體素（LH）的刺激，從卵泡閉鎖波中逃脫，這部分母豬斷奶發情間隔僅為3～4 d，并且快速進入排卵前階段[1]。由此可見，即使發情周期實現同步化，但卵泡發育仍然不同步。

2）母豬卵泡發育是受生殖激素的調控。母豬斷奶后往往受多種因素影響，會干擾LH等激素的分泌進而影響到卵泡的發育進程。研究發現，經產母豬斷奶前后釋放LH的模式不同，斷奶前表現為低頻高振幅，斷奶后則以高頻低振幅為特點（圖2）。

圖1 母豬斷奶-排卵期間卵泡直徑的變化（取自3～5個最大卵泡的平均直徑）；（A）初產母豬斷奶-排卵間隔（◇：小于 6 d；■：6-7 d；△：8-9 d；※：大于 10 d）；（B）經產母豬斷奶-排卵間隔（▲：4 d；■：5 d；◆：6 d）

圖2 母豬斷奶前LH分泌模式（A）和斷奶后分泌模式（B）

圖3 B超實時超聲斷奶母豬巢卵泡生長圖像 A：母豬斷奶時卵泡直徑約3 mm； B：母豬斷奶后86～96 h卵泡直徑約6～8 mm（引自Sean O’Leary and Mark Nottle）

哺乳期間母豬能量負平衡會干擾LH的釋放模式，而卵泡發育、成熟與LH脈沖密切相關。尤其是初產母豬，斷奶時卵泡發育受LH影響較大，其斷奶時卵泡直徑平均約為2.5 mm，排卵時直徑達到7.0 mm。經產母豬斷奶時卵泡發育受LH脈沖影響相對較小，斷奶、排卵時卵泡平均直徑分別為3.3 mm 和 8.0 mm[2]（圖 3）。

2.2 促卵泡發育的激素制劑研發應用

卵泡發育是復雜的生物學事件，定時輸精需使卵泡發育同步化，但是不同生殖激素發揮著不同的作用。研究表明用純化后的促卵泡素（FSH）、LH每8 h處理一次母豬，連續處理64 h后發現，經FSH處理的母豬卵巢上3～6 mm的竇狀卵泡數量很多，但直徑均沒有突破6 mm。經LH處理的母豬卵巢卵泡數量雖然少，但已達到排卵卵泡直徑標準7～9 mm，這說明FSH可以增加中等卵泡的數量（卵泡募集），但卵泡進一步生長、發育則需要LH的刺激（卵泡優勢化）。

為使母豬卵泡發育達到同步此，可采用外源性促性腺激素對卵泡發育進行調控。目前，刺激卵泡發育的常見激素有孕馬血清（PMSG/eCG）、PG600、以及GnRH的激動劑等。

PMSG屬于糖蛋白，其兼有FSH和LH的活性，但以FSH活性為主，在刺激卵泡同步發育方面具有很好的效果。研究表明經產母豬斷奶后24 h注射500～750 IU的PMSG能促使母豬卵泡同步發育，后備母豬和初產母豬由于內源性LH濃度較低，在應用PMSG促進母豬卵泡發育時劑量需增加到900～1 000 IU，停喂烯丙孕素后40 h肌肉注射1 000 IU的PMSG可促進卵泡同步發育。雖然PMSG促進卵泡發育取得較好的效果，但國內外研究認為PMSG產品批次之間生物活性差異很大，導致應用效果不穩定，因此，除了在生產提取工藝上對PMSG進行純化外，PMSG與人絨毛膜促性腺激素（hCG）等激素組合也被用于研究母豬卵泡同步發育。

PG600是由400 IU的PMSG和200 IU的hCG組成，研究顯示PG600處理母豬不僅可縮短斷奶發情間隔，卵泡發育速度也更快、斷奶后同一時間點卵泡直徑更大。PG600處理泌乳母豬時，雖然能刺激卵泡發育至排卵前階段，但斷奶發情間隔顯著延長。并且，可能是由于hCG具有LH效應，兩者組合使用引起一定比例的卵泡囊腫或黃體化。研究表明，當PMSG、hCG劑量分別從400 IU增加到700 IU、200 IU增加到350 IU時，母豬卵巢囊腫病變率由36%升至88%，同時妊娠率顯著下降。德國經過大量試驗表明，經純化凍干后的PMSG粉劑用于刺激卵泡發育時，母豬受胎效果要顯著優于PMSG和hCG的聯合制劑。

GnRH的激動劑如Maprelin也可以用于刺激卵泡同步發育，并被認為是PMSG的替代品。Maprelin注射閹豬時表現出FSH活性，研究表明其用于刺激初產、經產母豬時卵泡發育、配種受胎率等指標與PMSG相當。hCG也能夠促進卵泡的發育，但配種后母豬受胎率受到一定的影響。目前，誘導母豬卵泡同步發育研究及應用方面，依然以PMSG為主。

3 卵泡排卵同步化

自然條件下，母豬排卵持續時間長達6 h，這使部分卵子在與精子相遇前，已經失去受精能力或死亡，輸精時間不當將直接影響配種受胎率，所以，排卵同步化對于定時輸精的成敗至關重要。PMSG等促性腺激素雖然可實現母豬卵泡發育同步化，但母豬個體之間受品種、胎次、管理等因素影響，發情差異較大、排卵前LH峰出現時間不一致、排卵時間分散。為使母豬排卵時間更集中，通常需要在注射PMSG基礎上再注射促排卵激素進行處理，最終實現卵泡發育及排卵的同步化，為精準定時輸精建立基礎（圖4）。

在排卵的啟動中，GnRH起到了關鍵的調控作用。生理條件下，卵泡分泌的雌激素正反饋作用于下丘腦釋放GnRH刺激垂體，促進LH的分泌并達到排卵前LH峰值，引發卵泡破裂排卵。GnRH是由10個氨基酸組成的十肽，第1-4位氨基酸和第9-10位氨基酸高度保守，但第6和第7位、第9和第10位氨基酸之間的肽鍵極易被裂解酶分解斷裂，因此，GnRH在體內極易失活。為提高GnRH的穩定性，人工合成了一系列GnRH類似物，如曲普瑞林、布舍瑞林、戈舍瑞林、亮丙瑞林、那法瑞林等等（如圖5）。

目前某些GnRH類似物已在國外進行試驗研究[3]，并且部分結果表明，GnRH或其類似物可誘導內源性排卵前LH峰的出現，降低發情排卵間隔變異，用于母豬排卵同步化處理（圖6）。

3.1 曲普瑞林誘導母豬同步排卵

2000年，kraeling研究發現曲普瑞林能夠誘導雌激素處理的后備母豬出現LH峰，隨后Baer進一步確認曲普瑞林能夠誘導母豬排卵。目前，針對曲普瑞林研究較多的是將其制成凝膠狀，并通過特殊注射器定量將藥物置于母豬陰道，經黏膜吸收刺激母豬排卵（如圖7）。

圖4 性周期同步化母豬在PMSG、GnRH處理后達到排卵同步化

圖5 GnRH類似物及其分子結構模式圖

Knox將曲普瑞林凝膠注入母豬陰道篩選給藥時間和劑量[4]。發現200 μg曲普瑞林處理后48 h可使81%的母豬排卵。進一步研究發現，在斷奶后72 h、84 h、96 h的不同時間點給予200 μg曲普瑞林陰道凝膠，結果顯示處理后40 h，3組母豬排卵比例分別達到56.5%、62.2%和13%；處理后48 h，3組母豬排卵比例均達到64%，同時，自然發情對照組僅有34%母豬出現排卵，此試驗說明母豬斷奶后96 h給予200 μg曲普瑞林凝膠能使母豬排卵更集中。進一步分析發現，斷奶96 h陰道凝膠處理組母豬斷奶排卵間隔顯著縮短，妊娠率、分娩率達到自然狀態下母豬發情鑒定、適時輸精生產的水平。試驗中，雖然72 h、84 h處理后母豬排卵提前至少10 h，但采用人工輸精后，兩組配種妊娠率顯著降低20%～50%，分娩率降低30%～50%，其可能原因是激素處理時間較早，此時卵子尚未徹底成熟，曲普瑞林誘發LH峰后卵泡提前排卵，導致輸精后精子未能與卵子在合適的時間完成受精，也可能是未成熟的卵子受精后胚胎質量較低，在早期發育階段死亡。

后備母豬經烯丙孕素處理達到發情周期同步化[5]，間隔120 h，分別用 100 μg、200 μg、400 μg 曲普瑞林凝膠誘導其排卵，發現在處理后48 h母豬集中排卵，其中以200 μg劑量組誘導排卵集中度最高（圖8）。進一步研究發現，停喂烯丙孕素后96 h、120 h、144 h給予200 μg曲普瑞林處理，結果發現120 h處理組母豬24～48 h內排卵比例達到80%，有效促進后備母豬的同步排卵。

3.2 布舍瑞林誘導母豬同步排卵

布舍瑞林作為GnRH的類似物，在誘導母豬同步排卵方面也獲得較多的關注。研究表明，母豬斷奶時肌肉注射600 IU的PMSG，間隔90 h后注射布舍瑞林，并在30 h后進行第一次配種，結果發現能夠顯著縮短母豬斷奶到排卵的間隔，并且在布舍瑞林處理后32 h，排卵母豬比例達到95%以上。當僅用布舍瑞林處理斷奶母豬時，斷奶排卵間隔雖然也能顯著縮短，但效果不如與PMSG聯合使用。在另一項研究中發現，大白母豬斷奶后94 h、104 h肌肉注射布舍瑞林，結果顯示，斷奶94 h布舍瑞林處理后32～56 h內排卵母豬比例達到100%，而104 h、以及自然發情組排卵母豬比例分別僅有66.7%、68.7%，說明布舍瑞林注射時間點的選擇對母豬排卵同步化至關重要。目前，國內獸藥企業正在積極開發布舍瑞林相關藥物，但其應用于定時輸精程序仍需要結合大量生產數據進行分析優化研究。

圖6 GnRH類似物單獨或與PMSG連用對母豬排卵前LH峰的影響（引自Sean O’Leary and Mark Nottle）

圖7 曲普瑞林凝膠陰道給藥模式圖

圖8 后備母豬曲普瑞林凝膠陰道給藥劑量篩選

3.3 其他促性腺激素誘導母豬同步排卵

hCG作為LH的類似物，可直接作用于卵巢。20世紀70年代初，東歐部分國家已經在用PMSG預處理母豬后，注射hCG誘導排卵，并且85%～90%的母豬在處理后42 h發生排卵。pLH是豬促黃體生成素，與hCG作用原理一致，研究表明母豬斷奶時注射600 IU PMSG，間隔80 h后注射5 mg pLH，通過B超監測排卵時間結果發現母豬在34.25～42.5 h后發生排卵，平均排卵時間為38.2 h。但由于這些激素存在一定的副作用，或提取困難、成本高等缺點，逐漸被市場上其他促排藥物代替。

就目前各種促排激素制劑而言，與其他蛋白類誘導排卵激素制劑如hCG、LH相比，GnRH及其類似物能夠刺激內源性LH的分泌，并且具有低毒、代謝快、價格低等優點，同時GnRH屬于小分子，重復使用不會引起機體產生抗體，安全性高，因此，獲得越來越多的關注。

4 卵泡發育同步化在定時輸精中的應用

事實上，母豬發情周期、卵泡發育及排卵同步化調控效果與豬場管理、母豬品種、激素制劑效價及穩定性等密切相關。近幾年，豬場批次化生產在國內引起了高度關注，不少豬場開始建立三周批次、四周批次等批次化模式生產，先期嘗試引入國外的簡式或精準定時輸精程序，但是出現了諸多效果不一的問題，有人甚至對定時輸精技術產生了疑問。為此，國內一些高校、科研單位、動物制藥企業與養豬企業相繼開展了定時輸精技術的研發與生產試驗。其中，全國豬定時輸精協作組在國家重點研發計劃等項目支持下，結合我國實際生產及豬場管理情況，開展了較為系統的定時輸精程序的優化研究。通過許多次探索研究，項目組成功將B超技術應用于母豬卵泡的動態檢查，以直觀呈現卵巢對激素制劑處理的應答效應，直接應用生產中開展定時輸精程序優化的研究。借助B超技術對定時輸精的激素制劑處理后的卵泡發育實時檢查分析[6]，不斷進行激素制劑使用與輸精時機的調整，通過生產試驗建立了母豬發情促排模式的定時輸精程序（圖9上）；另外，在前期精準式程序基礎上優化出了兩點式查情定時輸精程序（圖9下）。

圖9 發情促排定時輸精程序（上）、兩點式查情定時輸精（下）

經過多個規?；i場連續多批次的生產應用，優化的定時輸精程序在生產中取得了較穩定的生產效果，顯著提高了批次母豬的受胎率、分娩率與利用率，母豬利用率的提高也為批次化生產中母豬群周轉安排提供了方便，促進了豬場批次化生產的整體效率提高，有效推動我國規?；i場連續式生產向批次化生產的轉變。