沒食子酸對美國白蛾幼蟲營養效應及解毒酶活性的影響

武 磊，李路莎，王立穎，袁郁斐，陳 敏*

(1.北京林業大學林木有害生物防治北京市重點實驗室，北京 100083；2.承德市圍場滿族蒙古族自治縣林業局，河北承德 068450)

在植物-昆蟲互作過程中，一方面植物為植食性昆蟲的生長發育提供營養需求，同時，植物通過多種方式抵抗昆蟲的取食(Rani and Jyothsna，2010;Waretal.，2011a;2011b)。其中，次生代謝物在植物抵御昆蟲的取食中發揮著重要的作用。酚類是最廣泛的植物次生代謝物之一，主要包括植物多酚、黃酮類、萘醌、苯醌和木質素等(張力平等，2005;張雅靜，2014)。次生代謝物通常對昆蟲的取食、生長發育和繁殖等生命活動產生不利影響，甚至具有毒殺的效果(王亞軍等，2017)。

在長期的進化過程中，昆蟲同樣形成了行為、生理和生化等多種防御機制來抵御這些有毒次生物質對其造成的影響(彭露等，2010)。昆蟲在遭受植物次生代謝物質的毒害時，能夠利用體內自身的解毒酶系進行解毒排毒(王瑞龍等，2012)，如羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)和昆蟲細胞色素P450(P450)等。此外，乙酰膽堿酯酶(AchE)在植物-昆蟲互作過程中發揮重要的作用(王瑩，2008)，主要參與昆蟲突觸傳導，是殺蟲劑作用的重要靶點(Vanetal.，2005;王瑞龍等，2012)。生物化學及分子水平研究證實，昆蟲對植物次生物質的代謝能力與昆蟲的寄主范圍密切相關(陳澄宇等，2015)。如雜食性昆蟲棉鈴蟲Helicoverpaarmigera的CYP6B8能夠代謝花椒毒素、槲皮素、黃酮、綠原酸、吲哚3-甲醇和蕓香苷等多種植物次生物質(Lietal.，2004)，而寡食性昆蟲北美黑鳳蝶Papiliopolyxenes的CYP6B1僅能夠有效代謝線型和角型呋喃香豆素，對黃酮、α-萘黃酮的代謝能力較弱(Wenetal.，2003)。這表明與寡食性昆蟲相比，雜食性昆蟲具有更為強大的解毒酶體系(Ramseyetal.，2010)。

美國白蛾Hyphantriacunea原產北美洲，屬于鱗翅目Lepidoptera燈蛾科Arctiidae(Sullivanetal.，2011)。1979年在我國遼寧省丹東市首次發現美國白蛾(Yangetal.，2006;Chenetal.，2014)，目前已經擴散至11個省(區、市)共計572個縣級行政區(國家林業局2018年第3號公告)。美國白蛾寄主非常廣泛，世界范圍內寄主植物多達630余種(Sullivan and Ozman-Sullivan，2012)，中國地區的寄主植物超過300種(王鳳琴和桑成武，2008)。該害蟲被列為中國最重要的森林檢疫性有害生物之一(Zhangetal.，2016)。目前關于美國白蛾的生物生態學、種群遺傳學、性信息素開發及防治技術等方面已開展廣泛研究(Gomi，2007；Kimetal.，2011；Kiyotaetal.，2011；劉頡等，2012；Zibaeeetal.，2013；Caoetal.，2016)。但關于該害蟲對環境和廣泛寄主植物的適應機制的研究卻鮮有涉及。前期研究發現，美國白蛾幼蟲對不同寄主植物存在取食選擇和營養效應差異，取食不同寄主植物的美國白蛾幼蟲AchE、GSTs、CarE和P450的活性存在顯著差異(李路莎等，2018)。由于不同寄主植物所含次生代謝物的種類以及各類次生物質的含量各異，難以明確單一種類的次生物質對美國白蛾生理代謝的影響。

沒食子酸gallic acid是一種天然有機酚酸，具有多酚類和酸類物質的通性(Kimetal.，2006；Kangetal.，2008；Giftsonetal.，2009)，是植物防御植食性昆蟲的一種重要的抗蟲次生代謝物(Coruh and Ercisli，2010；黃敏燕和李雪峰，2018)，廣泛存在于大葉桉、楊、桑等常見植物的葉片中(柯發敏和張開蓮，2011；理永霞等，2011；丁雙華，2011)。陳巨蓮等(2003)研究發現沒食子酸對麥長管蚜Sitobionavenae的存活、生長和發育具有明顯的抑制作用，同時還對蔗糖酶、CarE和GSTs等多種解毒酶的活力表現出不同的作用效果。沒食子酸能夠顯著抑制青楊天牛Saperdapopulnea幼蟲體內CarE的活性，減弱CarE的解毒功能(謝興，2010)，但沒食子酸卻能夠誘導活化斜紋夜蛾Spodopteralitura體內CarE和GSTs等多種解毒酶的活性，參與解毒代謝棉花次生代謝物(Rainetal.，2013)。本研究擬通過在美國白蛾人工飼料中添加沒食子酸的方法，分析沒食子酸對美國白蛾的營養效應及對解毒酶和乙酰膽堿酯酶活性的影響，以探究美國白蛾對寄主植物中廣泛存在的該類次生代謝物的解毒代謝能力和生理響應模式。該研究結果將對揭示美國白蛾的寄主適應機制提供基礎資料，為進一步完善美國白蛾防控體系提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 沒食子酸人工飼料的配制及試蟲的飼養

先用蒸餾水配制濃度為4%沒食子酸溶液(CAS編號：149-91-7，AR，純度：99.0%，國藥集團)，70℃水浴加熱使其充分溶解。參照曹利軍等(2014)的方法配制美國白蛾人工飼料，按比例將一定體積的沒食子酸溶液加入到人工飼料中攪拌均勻，分別配制成含沒食子酸1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的美國白蛾人工飼料。沒食子酸濃度梯度的設定參照李路莎等(2018)測定的8種寄主植物總酚含量(16.00～55.85 mg/g)以及相關文獻中沒食子酸人工飼料的濃度設置范圍(王怡，2010;黃敏燕和李雪峰，2018)。

美國白蛾幼蟲于室內用人工飼料(曹利軍等，2014)飼養至4齡，選取生長狀況一致的4齡幼蟲作為供試蟲源。飼養條件：溫度25℃±1℃，相對濕度70%～80%，光周期12L ∶12D。

1.2 營養指標的測定

參照蘇超等(2013)的方法，分別用1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的沒食子酸人工飼料飼養美國白蛾幼蟲。先將幼蟲饑餓處理12 h以排空糞便，稱取幼蟲及人工飼料鮮重，用含沒食子酸的人工飼料飼養美國白蛾幼蟲48 h，再次稱取幼蟲及人工飼料的重量，繼續饑餓處理12 h，烘干后稱取幼蟲(CGZ2)、蟲糞(F)及飼料(YGZ2)重量。另外，飼養前稱取人工飼料和饑餓處理的4齡幼蟲鮮重，將與飼養用的飼料和試蟲等重的飼料和試蟲烘干至恒重，稱重記作取食前人工飼料干重(YGZ1)和取食前幼蟲干重(CGZ1)。以不添加沒食子酸的人工飼料作為對照組(CK)。每個培養杯接入5頭幼蟲，試驗重復3次。本試驗共測定4個營養效應指標：近似消化率(approximate digestibility,AD)、食物利用率(efficiency of conversion of ingested food,ECI)、相對取食量(relative consumption,RCR)和相對生長率(relative growth rate,RGR)(浦名偉，2007)。計算公式為：AD(%)=(I-F)/I×100；ECD (%)=G/(I-F)×100；ECI (%)=G/I×100；RCR (g/g·d)=I/(B×T)；RGR (g/g·d)=G/(B×T)。式中，B：試驗期間幼蟲的平均體重；F：糞便干重；G：蟲體增重量；I：幼蟲的取食量；T為試驗天數。G= CGZ2-CGZ1；B=(CGZ1+CGZ2)/2；I= YGZ1-YGZ2。

1.3 解毒酶和乙酰膽堿酯酶活性測定

1.3.1酶提取液的制備

4齡幼蟲饑餓處理12 h后，轉移至含不同濃度沒食子酸的人工飼料上飼養，每個培養杯接 5頭幼蟲作為1個重復，每個濃度梯度共設3個重復，即每個濃度共15頭幼蟲，分3個培養杯飼喂。將飼養后的幼蟲放入冰冷生理鹽水(0.86% NaCl)中清洗，除去雜質。蟲體經濾紙拭干后稱重，放入PE管。量取9倍體重的冷生理鹽水，加入PE管。用研磨儀研磨蟲體制成組織勻漿。4℃低溫(12 000 r/min)離心10 min，取上清液作為酶提取液，以不添加沒食子酸的人工飼料飼養的美國白蛾4齡幼蟲的酶提取液作為對照。

1.3.2解毒酶及乙酰膽堿酯酶活性的測定

分別用1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的沒食子酸人工飼料飼養美國白蛾幼蟲24 h后，分別測定CarE、GSTs和P450 3種解毒酶和AchE的活性。同時，用濃度1.0%的沒食子酸人工飼料飼養美國白蛾4齡幼蟲不同時間(12，24，36，48 h，60 h)后，測定4種酶的活性，分析較低濃度的沒食子酸對美國白蛾4齡幼蟲解毒酶和AchE活性的影響。

總蛋白測定試劑盒(編號A045-3)、乙酰膽堿酯酶測定試劑盒(編號A024)、羧酸酯酶測定試劑盒(編號A024)和谷胱甘肽S-轉移酶測定試劑盒(編號A004)均購自南京建成生物，昆蟲細胞色素P450測定試劑盒(編號JL22832)購自上海江萊生物有限公司。各種酶活性的測定步驟及計算方法具體參照試劑盒說明書。

1.4 數據處理

用Excel 2016統計及整理數據，采用SPSS 19.0 for Windows的one-way ANOVA分析檢驗4個營養效應指標(AD、ECI、RCR和RGR)、乙酰膽堿酯酶和解毒酶活性的均值及差異顯著性(Tukey’s test,P<0.05)。用Origin 2018對不同濃度和不同處理時間的美國白蛾幼蟲的乙酰膽堿酯酶與解毒酶的活性進行作圖。

2 結果與分析

2.1 沒食子酸對美國白蛾的營養效應的影響

取食不同濃度沒食子酸的人工飼料48 h后，各處理試蟲的4項營養指標統計結果如表1。與對照組相比，不同濃度的沒食子酸對美國白蛾幼蟲的AD、ECI、RCR和RGR均產生顯著影響(P<0.05)(表1)。ECI和RGR均不同程度的高于對照組。不同濃度沒食子酸處理的美國白蛾幼蟲的AD和RCR均低于對照組。

2.2 沒食子酸對美國白蛾乙酰膽堿酯酶和解毒酶活性的影響

2.2.1不同濃度沒食子酸對美國白蛾4齡幼蟲乙酰膽堿酯酶和解毒酶活性的影響

用5個濃度梯度(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%)的沒食子酸人工飼料分別飼養美國白蛾4齡幼蟲24 h后，AchE、CarE、GSTs和P450的活性如圖1所示。結果表明，不同濃度的沒食子酸對美國白蛾幼蟲AchE、CarE、GSTs和P450的活性均有顯著影響(P<0.05)。由圖1A可見，1.0%沒食子酸對美國白蛾幼蟲AchE的活性具有一定抑制作用，但隨著沒食子酸濃度提高AchE的活性上升，隨后又逐漸恢復到對照組的水平。濃度為1.0%～3.0%的沒食子酸處理的美國白蛾幼蟲CarE的活性均顯著低于對照組(圖1B)，表明沒食子酸對美國白蛾幼蟲CarE的活性具有顯著抑制作用。較低濃度(1.0%～1.5%)的沒食子酸對GSTs的活性有一定誘導作用，但隨著沒食子酸濃度提高，GSTs的活性卻受到一定程度的抑制(圖1C)。不同濃度的沒食子酸處理的美國白蛾幼蟲的P450活性始終高于對照組，且在沒食子酸濃度為1.5%～2.0%時誘導作用最強，表明沒食子酸在供試濃度范圍內均能誘導美國白蛾幼蟲P450的活性(圖1D)。

表1 沒食子酸人工飼料對美國白蛾4齡幼蟲營養效應的影響Table 1 Nutritional efficiency of the 4th instar larvae of Hyphantria cunea feeding on gallic acid diets

注：表中數據為平均值±標準誤，同一列數據后不同字母表示差異顯著(Tukey氏檢驗,P<0.05)。Note:Data in the table are mean±SEand different letters following the data in a column show significant difference (Tukey’s test,P<0.05).

圖1 取食不同濃度沒食子酸飼料的美國白蛾4齡幼蟲乙酰膽堿酯酶(A)和解毒酶(B-D)活性Fig.1 Activities of the acetylcholinesterase (A) and detoxification enzymes (B-D) of the 4th instar larvae of Hyphantria cunea feeding on different concentrations of gallic acid diets注：柱上不同小寫字母代表不同濃度沒食子酸處理的酶活性的差異顯著性(Tukey氏檢驗，P<0.05)。Note:Different letters above bars show significant difference of enzyme activities with different concentrations of gallic acid treatment (Tukey’s test,P<0.05).

圖2 1.0%沒食子酸人工飼料處理不同時間的美國白蛾4齡幼蟲的乙酰膽堿酯酶(A)和解毒酶(B-D)活性Fig.2 Activities of the acetylcholinesterase (A) and detoxification enzymes (B-D) of the 4th instar larvae of Hyphantria cunea treated by 1.0% gallic acid artificial diets for different time注：柱上不同小寫字母代表1.0%沒食子酸處理不同時間的酶活性的差異顯著性(Tukey氏檢驗，P<0.05)。Note:Different letters above bars show significant difference of enzyme activities with different treatment time of 1.0% gallic acid (Tukey’s test,P<0.05).

2.2.21.0%沒食子酸不同處理時間對美國白蛾4齡幼蟲乙酰膽堿酯酶和解毒酶活性的影響

用含1.0%沒食子酸的人工飼料飼養美國白蛾4齡幼蟲，分別測定飼養12、24、36、48、60 h試蟲的乙酰膽堿酯酶和解毒酶的活性，結果如圖2所示。1.0%沒食子酸處理不同時間的美國白蛾4齡幼蟲的AchE、CarE、GSTs和P450的活性變化均差異顯著(P<0.05)。在處理時間范圍內，1.0%濃度沒食子酸處理的美國白蛾幼蟲的AchE和CarE的活性低于對照(圖2A，圖2B)，表明AchE和CarE的活性始終受到沒食子酸的抑制，并且隨著處理時間延長，沒食子酸對兩種酶的活性抑制作用逐漸增強。總體上1.0%沒食子酸對美國白蛾GSTs的活性影響較小，24 h之內，處理組的GSTs的活性稍高于對照，但24 h之后與對照組的GSTs活性相當(圖1C)。在處理時間范圍內，沒食子酸處理的美國白蛾幼蟲的P450活性始終高于對照組(圖1D)，表明1.0%沒食子酸對P450的活性有持續穩定的誘導作用。可見，沒食子酸對不同解毒酶和乙酰膽堿酯酶活性的影響不同，不同的解毒酶和乙酰膽堿酯酶對沒食子酸的響應模式也不同。

3 結論與討論

通過在美國白蛾人工飼料中添加不同濃度的沒食子酸，研究沒食子酸對美國白蛾幼蟲營養效應指標和解毒代謝相關酶系的影響，以及不同酶類隨著沒食子酸濃度和作用時間變化的代謝響應模式。營養效應指標結果顯示(表1)，沒食子酸的存在導致美國白蛾幼蟲的近似消化率和相對取食量降低，表明美國白蛾幼蟲可能通過降低食物取食量和食物消化率以減少酚類次生代謝物質的毒害，而通過提高食物的利用率以滿足其生長發育所需的營養，而且其相對生長量隨著沒食子酸濃度的增加有所提高，表明一定濃度沒食子酸的短期作用(48 h)并沒有影響其生長，反映美國白蛾幼蟲對一定濃度沒食子酸具有較強的生理適應能力。Hamamura等(1966)用含沒食子酸的人工飼料飼喂家蠶Bombyxmori幼蟲發現幼蟲生長速度加快的現象。棉鈴蟲取食添加煙堿的人工飼料后相對取食量和近似消化率均顯著下降，但食物利用率一定程度升高，生長率并沒有出現下降(董鈞峰等，2002)。蘇超等(2013)研究不同植物對三條橙燈蛾Lemyraalikangensis生長發育的影響，結果表明天仙果飼喂的幼蟲生長率與華東油柿飼喂的幼蟲生長率相同，但消化率顯著低于華東油柿飼喂組，而食物利用率顯著高于華東油柿飼喂組。王桂花等(2016)研究3種植物對斜紋夜蛾的營養效應，結果表明3種植物間處理的斜紋夜蛾幼蟲生長率差異不明顯，但花生處理的幼蟲取食量和消化率低于香蕉和芒果處理的幼蟲，而食物利用率要高于其他兩個植物處理的幼蟲。昆蟲取食植物量和對植物利用方面存在一定的補償機制(朱俊洪等，2005)，昆蟲通過內部的調節適應植物次生代謝物。美國白蛾幼蟲提高食物利用效率可能是對取食量減少的一種補償，以保證自身獲得足夠的能量。

植物次生代謝物可以誘導昆蟲乙酰膽堿酯酶及解毒酶系的活性，提高昆蟲的適應能力(Caietal.，2005;Hlavica，2011)。本研究結果表明，沒食子酸在供試濃度和作用時間范圍內能夠持續穩定地誘導美國白蛾幼蟲P450的活性，活化的P450在消化道和脂肪體等器官和組織內將次生代謝物降解為可溶或毒性更低的形式(Feyereisen，1999;Chungetal.，2006;Wangetal.，2014;Cuietal.，2016)，從而賦予美國白蛾幼蟲對該類次生代謝物的抗性。沒食子酸能顯著抑制美國白蛾幼蟲CarE的活性(圖1B，圖2B)。沒食子酸濃度較低且處理時間較短時，能夠一定程度誘導美國白蛾幼蟲GSTs的活性(圖2C)，但隨著沒食子酸濃度升高，GSTs的活性卻受到一定程度抑制(圖1C)。Zhou等(2016)認為低濃度的次生代謝物誘導GSTs的活性是昆蟲的一種應急適應，高濃度次生代謝物產生的較強毒害作用會抑制酶活性。較低濃度的沒食子酸(1.0%)隨著處理時間的延長對AchE活性的抑制作用卻加強(圖2A)。上述結果表明，沒食子酸對美國白蛾幼蟲不同的解毒酶和乙酰膽堿酯酶具有不同的誘導或抑制作用，反映不同酶類在應對沒食子酸的作用中具有不同的響應模式。王怡(2016)通過人工飼料添加沒食子酸的方法研究次生代謝物沒食子酸對玉米蚜Rhopalosiphummaidis解毒酶活性的影響，同樣發現沒食子酸對不同酶作用效果不同，沒食子酸能夠誘導玉米蚜CarE和P450的活性，但不影響AchE的活性。用1.0%沒食子酸處理斜紋夜蛾，發現幼蟲的AchE和GSTs活性均不同程度增加(黃敏燕和李雪峰，2018)。牟少飛等(2006)研究酚類物質槲皮素對B型煙粉虱Bemisiatabaci的CarE和GSTs活性影響時發現，低濃度槲皮素短時間處理誘導CarE和GSTs活性，但高濃度的次生代謝物會抑制酶活性的發揮。由此可見，植物次生代謝物對昆蟲解毒酶等酶系活性的誘導是一個復雜的過程，不同酶之間相互協調完成對有毒次生代謝物的解毒代謝(朱香鎮等，2018)。

本研究針對沒食子酸對美國白蛾幼蟲營養效應的影響和解毒酶等酶類的作用進行研究，發現美國白蛾幼蟲可通過調節對食物的利用和誘導活化解毒酶的活性，增強對沒食子酸的代謝能力，從而對含沒食子酸的寄主植物產生適應性。植物次生代謝物的短期作用，會提高昆蟲利用植物營養的效率和解毒酶類的活性。但有研究表明次生代謝物長期作用可能會對昆蟲的生長發育、行為、繁殖等生命活動產生不利影響，甚至具有毒殺的效果(Delvasetal.，2011;王亞軍等，2017)。因此，要全面認識美國白蛾幼蟲對植物中沒食子酸等次生代謝物化學防御的應對策略，還需持續觀察沒食子酸對美國白蛾完整發育周期的各項生理生化和生長發育指標的影響，甚至從基因水平探討其分子調控機理，從而揭示美國白蛾對寄主植物的適應機制。