湘西峒河流域星齒蛉幼蟲分子鑒定與體表呼吸結構觀察

潘鳳溜，瞿玉國，張佑祥，向 穎，趙馳珺，曹成全,3，黃興龍*

(1.吉首大學生物資源與環境科學學院，吉首 416000；2.古丈縣農業農村局，湘西 416300；3.樂山師范學院生命科學學院，樂山 614004)

星齒蛉屬Protohermes隸屬于昆蟲綱Insecta廣翅目Megaloptera齒蛉科Corydalidae，是齒蛉亞科Corydalinae最大的屬(Liuetal.,2013)。我國是星齒蛉種類最豐富的國家，目前已知超過38種，占全世界已知種類的70%(Liuetal.,2006)。星齒蛉是原始的完全變態昆蟲，幼蟲水生，蛹和成蟲陸生(Hayashietal.,1988)，幼蟲大多棲息于生態環境優越的河流溪溝中，對水質變化敏感，因此星齒蛉也被廣泛用于淡水生態系統的水質監測(王備新和楊蓮芳，2004；楊定和劉星月，2010)。星齒蛉幼蟲體表具有多種呼吸結構，胸部和腹部分別具有2對和8對氣門，1～8腹節各具有一對氣管鰓；此外，1～7腹節氣管鰓下方還具有毛簇(楊定和劉星月，2010)。在鞘翅目和蜻蜓目的研究中發現，具有氣管鰓的水生昆蟲，主要以氣管鰓進行氣體交換獲取生命活動所需的O2(鄭霞林等，2007；馬龍和張明峰，2012)。Barclay等(2005)對齒蛉亞科新齒蛉屬Corydalus昆蟲的研究發現，Corydaluscornutus幼蟲毛簇具有大量纖毛，每條纖毛中具有一條氣管，并推測毛簇是新齒蛉屬幼蟲的主要呼吸結構。星齒蛉屬為齒蛉亞科中最大的屬，但是關于星齒蛉幼蟲體表呼吸結構觀察的報道比較缺乏。

峒河，也被稱作武水，是湘西土家族苗族自治州南部的主要河流，源頭位于花垣縣雅酉鎮，于瀘溪縣武溪鎮匯入沅江，干流總長約150 km，主要支流包括洽比河、龍午河、司馬河和丹清河(朱程等，2010)。峒河流域植被覆蓋率高，動植物種類極為豐富，是我國生態安全建設和生態扶貧的重點區域(邵佳和冷志明，2016)。同時，峒河流域也是土家族和苗族聚居區域。當地少數民族群眾常在河流、溪溝中捕撈和食用俗稱“桃花蟲”和“水蜈蚣”的水生昆蟲(賈維秀，2016)。這些昆蟲食品也是苗族百蟲宴的核心內容之一。實地調查發現，桃花蟲和水蜈蚣是多種水生昆蟲的統稱，桃花蟲主要指蜻蜓目稚蟲，水蜈蚣主要指星齒蛉幼蟲。因此星齒蛉在當地生態系統和少數民族文化中具有重要地位。但是，目前峒河流域的星齒蛉種類還不明確。

線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因序列廣泛用于昆蟲的系統地位和系統發育關系分析(張丹丹等，2017)。星齒蛉幼蟲形態與其他齒蛉亞科幼蟲形態相似，傳統的星齒蛉分類鑒定主要通過觀察成蟲的形態學特征。近年來，星齒蛉屬昆蟲的分子生物學研究不斷深入，文獻報道了Protohermesconcolorus線粒體基因組和67條星齒蛉屬昆蟲COⅠ基因片段序列信息，使基于COⅠ基因的星齒蛉屬昆蟲分子鑒定成為可能(Huaetal.,2008；Changetal.,2013)。Jung等人(2016)的研究證實，COⅠ基因序列可作為DNA條形碼，用于廣翅目幼蟲的分類鑒定。本研究通過COⅠ基因序列分析對峒河流域星齒蛉幼蟲進行了鑒定，并對其體表呼吸結構進行了觀察，以期為星齒蛉的保護和開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 昆蟲采集和形態學觀察

本研究于2018年9-10月對峒河流域進行星齒蛉幼蟲采集，樣線涵蓋峒河干流以及支流洽比河、龍午河、司馬河和丹青河。峒河及其支流兩岸為山地，植被覆蓋率高，村落和農田沿河分布。每條河流選取3個樣點，每個樣點選取2 m×2 m的樣方3個。單個樣方由1人使用寬度30 cm、網孔2 mm的D形網捕撈15 min，然后以樣方為單位將捕獲的星齒蛉幼蟲放入打孔的塑料盒，帶回實驗室數量統計。部分幼蟲直接用于形態特征觀察，然后進行DNA提取或浸泡在80%酒精中，于4℃冰箱長期保存。其余幼蟲在室內飼養，并在2019年6月羽化獲得成蟲，對成蟲進行了形態學鑒定。使用外接數碼相機(D810，尼康)的體視顯微鏡(XTL-165-VT，鳳凰)進行形態學觀察和拍照，照片由Photoshop 7.0軟件(Adobe)進行裁切和圖層疊加。用于觀察氣管分布情況的星齒蛉幼蟲新鮮標本浸泡于含0.03% Triton X-100和0.85% NaCl磷酸緩沖液中，4℃放置24 h。形態學特征描述參考楊定和劉星月(2010)。

1.2 PCR擴增

按照EasyPure Genomic DNA Kit(北京全世金)試劑盒說明書的操作步驟提取幼蟲一側中足和胸部肌肉組織DNA。用于COⅠ基因擴增的通用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，上下游引物序列分別為(P3:5′-CAACATTTATT TTGATTTTTTGG-3′)和(P4:5′-TCCATTGCACT AATCTGCCATATTA-3′)(Yangetal.,2017)。PCR反應體系為25 μL，包含PCR Mastermix(北京康為世紀)12.5 μL，上下游引物各1 μL，模版DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應程序為94℃預變性5 min；94℃變性1 min，50℃退火45 min，72℃延伸1 min，共35個循環；最后72℃延伸10 min。PCR產物經10%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.3 序列分析

測序結果通過NCBI網站的Blastn服務(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進行相似性比較，確定PCR擴增得到的序列是否來自齒蛉科昆蟲。使用Clustal X 1.83軟件進行多重序列比對(Thompsonetal.,1997)。通過Mega 5.0軟件計算星齒蛉COⅠ基因序列的遺傳距離。使用Mega 5.0軟件構建系統發育樹，采用鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)和最大似然法(Maximum likelihood,ML)，重復1 000次(Tamuraetal.,2011)。用于構建系統發育樹的COⅠ基因序列除來自峒河流域星齒蛉標本外，還包括Genbank中齒蛉亞科昆蟲的COⅠ基因序列，分別來自巨齒蛉屬Acanthacorydalis、齒蛉屬Neoneuromus,以及星齒蛉屬的花邊星齒蛉種團和炎黃星齒蛉種團(表1)。

2 結果與分析

2.1 峒河流域星齒蛉

通過對峒河干流及其4條支流進行了水生昆蟲采集，共發現兩種外部形態存在差異的星齒蛉幼蟲，星齒蛉A和星齒蛉B(表2)。洽比河、司馬河和丹清河，兩種星齒蛉幼蟲均有分布；而在峒河干流和龍午河僅發現星齒蛉A。星齒蛉幼蟲在室內羽化得到的成蟲經形態學鑒定，星齒蛉A為花邊星齒蛉Protohermescostalis和星齒蛉B為炎黃星齒蛉Protohermesxanthodes。

2.2 遺傳距離

選取3頭星齒蛉A標本(P001、P002和P003)和2頭星齒蛉B標本(P004和P005)用于DNA提取和COⅠ基因序列分析。P001、P002和P003 COⅠ基因序列與Genbank中的花邊星齒蛉COⅠ基因序列同源性達到99%，初步認定為花邊星齒蛉；P004和P005 COⅠ基因序列與炎黃星齒蛉COⅠ基因序列同源性為99%，初步認定為炎黃星齒蛉。

利用MEGA 5.0軟件計算峒河流域星齒蛉標本COⅠ基因序列與Genbank中花邊星齒蛉種團和炎黃星齒蛉COⅠ基因序列的遺傳距離(表3)。花邊星齒蛉種團內種間遺傳距離在0.060～0.095之間，花邊星齒蛉種團各種與炎黃星齒蛉種間遺傳距離為0.085～0.106。P001、P002和P003之間的遺傳距離在0.012～0.030，低于種間遺傳距離；三者與花邊星齒蛉遺傳距離分別為0.016、0.033和0.020，也低于種間遺傳距離，說明P001、P002、P003與花邊星齒蛉為同一物種。P004和P005遺傳距離為0.04，低于種間遺傳距離；二者與炎黃星齒蛉的遺傳距離分別為0.009和0.011，也低于種間遺傳距離，說明P004和P005屬于炎黃星齒蛉。

表1 用于系統發育分析的齒蛉亞科COⅠ基因序列Table 1 COⅠ gene sequences of Corydalinae used in the phylogenetic analysis

2.3 系統發育分析

以齒蛉亞科3屬(星齒蛉屬、齒蛉屬和巨齒蛉屬)的COⅠ基因構建系統發育樹。NJ法和ML法構建的系統發育樹中，星齒蛉屬、齒蛉屬和巨齒蛉屬均各自聚為一支(圖1:A,B)；P001、P002、P003、P004和P005位于星齒蛉屬昆蟲構成的分支；其中P001、P002、P003位于花邊星齒蛉種團，與花邊星齒蛉聚為一支；P004和P005與炎黃星齒蛉聚為一支。綜合考慮遺傳距離分析結果和系統發育分析結果，峒河流域采集的星齒蛉A和B分別屬于花邊星齒蛉和炎黃星齒蛉。

表2 樣點星齒蛉幼蟲數量Table 2 Number of Protohermes larvae in the sample sites

表3 基于COⅠ基因序列的星齒蛉遺傳距離Table 3 Genetic distance of Protohermes based on COⅠ gene sequence

圖1 基于COⅠ基因的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic treesbased on COⅠ gene sequence注：A,基于COⅠ基因的NJ樹;B,基于COⅠ基因的ML樹。Note:A,NJ trees based on COⅠ gene sequence;B,ML trees based on COⅠ gene sequence.

2.4 外部形態

炎黃星齒蛉幼蟲體長50.0～53.6 mm，體粗長，略扁(圖2:A,B)。頭部方形，深棕色或棕色，表面光滑，背面具有黃色花(圖2:C)；上唇三角形，上顎發達，具有4個小齒；觸角5節，第3節較長，端部兩節較短。前胸背板方形，與頭部等寬，深棕色或棕色，具有黃色斑紋(圖2:E)；頭部背面和前胸背板斑紋形狀在個體間存在一定差異，同一個體左側和右側斑紋也存在細微變化。中胸和后胸背面淺棕色，具有黃色斑紋(圖2:F)。前胸與中胸之間、中胸與后胸之間各具有1對氣孔。腹部10節，表面具有大量剛毛；1-8腹節各具有一對氣管鰓，鞭狀，表面具有剛毛，第8腹節氣管鰓剛毛較長呈羽狀；每條氣管鰓基部前方具有1個氣孔；1-7腹節氣管鰓下具有濃密的白色毛簇，第8腹節氣管鰓下無毛簇(圖2:H)；第9腹節無特化的結構；第10腹節具一對鉤狀臀足，臀足末端具2個爪，臀足外側具1刺突，形狀與第8腹節氣管鰓相似，呈羽狀，但更短小(圖2:H)。

花邊星齒蛉幼蟲體長46.2～51.7 mm，體粗長，略扁(圖2:I,J)。頭部方形，淺棕色，背面斑紋黃色；上唇三角形，上顎發達，具4個小齒(圖2:K)；觸角5節，端部兩節較短，第三節較長。前胸背板與頭部等寬，或略寬于頭部，斑紋不明顯(圖2:M)。中胸和后胸背面淺棕色，具有黃色斑紋(圖2:N)。前胸與中胸之間、中胸與后胸之間各具有1對氣孔。腹部10節，表面具有大量剛毛；1-8腹節各有一對鞭狀氣管鰓，表面具有剛毛；每條氣管鰓基部前方具有1個氣孔，1-7腹節氣管鰓下方具棕色或白色毛簇，第8腹節氣管鰓下無毛簇(圖2:P)；第9腹節無特化結構；第10腹節具一對鉤狀臀足，臀足末端具有2個小爪，臀足外側具1鞭狀刺突，形狀與氣管鰓相近，但更短小纖細(圖2:P)。

圖2 炎黃星齒蛉和花邊星齒蛉幼蟲Fig.2 Larvae of Protohermes xanthodes and Protohermes costalis 注:A,炎黃星齒蛉幼蟲背面觀;B,炎黃星齒蛉幼蟲腹面觀;C,炎黃星齒蛉頭部背面觀;D,炎黃星齒蛉頭部腹面觀;E,炎黃星齒蛉前胸背板;F,炎黃星齒蛉中胸、后胸背面;G,炎黃星齒蛉7-10腹節背面;H,炎黃星齒蛉7-10腹節腹面觀;I,花邊星齒蛉幼蟲背面觀;J,花邊星齒蛉幼蟲腹面觀;K,花邊星齒蛉頭部背面;L,花邊星齒蛉頭部腹面;M,花邊星齒蛉前胸背板;N,花邊星齒蛉中胸后胸背面;O,花邊星齒蛉7-10腹節背面;P,花邊星齒蛉7-10腹節腹面。Note:A,dorsal view of P.xanthodes larva;B:ventral view of P.xanthodes larva;C,dorsal view of P.xanthodes larva head;D:ventral view of P.xanthodes larva head;E,pronotum of P.xanthodes larva;F,mesothorax and metathorax of P.xanthodes larva;G,dorsal view of 7～10 abdominal segment of P.xanthodes larva;H,ventral view of 7～10 abdominal segment of P.xanthodes larva;I,dorsal view of P.costalis larva;J:ventral view of P.costalis larva;K,dorsal view of P.costalis larva head;L,ventral view of P.costalis larva head;M,pronotum of P.costalis larva;N,mesothorax and metathorax of P.costalis larva;O,dorsal view of 7～10 abdominal segment of P.costalis larva;P,ventral view of 7～10 abdominal segment of P.costalis larva.

2.5 體表呼吸結構

炎黃星齒蛉和花邊星齒蛉幼蟲腹部具有8對氣門，分別位于第1至第8腹節(圖3:A,I)。胸部具有2對氣門，分別位于中胸和后胸前端，后胸氣門較小；中胸氣門較大(圖3:B,J)。腹部和胸部氣門均具有單瓣式開閉機構，胸部氣門開閉機構位于氣孔后沿(圖3D,L)，腹部氣門開閉機構位于氣孔前沿(圖3:E,F,M,N)。沿氣門剪開體壁，可以觀察到胸部和腹部氣門均與內部氣管相連。

兩種星齒蛉第1至第8腹節均具有1對氣管鰓，第十腹節臀足外側具有1對氣管鰓狀刺突，第1至第7腹節氣管鰓下方具有濃密的氣管鰓毛簇。觀察發現，炎黃星齒蛉毛簇由兩叢小簇組成；小簇包含大量細長的纖毛，每條纖毛中均具有一條銀色的氣管(圖3:H)。花邊星齒蛉毛簇也由兩叢小簇組成，由于體壁顏色較淺，可以觀察到小簇基部與大量銀色微氣管相連，這些微氣管向纖毛延伸，直到纖毛端部(圖3:O)。而花邊星齒蛉氣管鰓和臀足只觀察到一條銀色的氣管(圖3:H)。

圖3 炎黃星齒蛉和花邊星齒蛉幼蟲體表呼吸結構Fig.3 Surface respiratory structures of Protohermes xanthodes and Protohermes costalis larva注:A,炎黃星齒蛉幼蟲腹部體表呼吸結構;B,炎黃星齒蛉幼蟲胸部體表呼吸結構;C,炎黃星齒蛉幼蟲氣管腮;D,炎黃星齒蛉幼蟲中胸氣門;E和F,炎黃星齒蛉幼蟲1-2腹節氣門;G,炎黃星齒蛉幼蟲毛簇;H,炎黃星齒蛉幼蟲毛簇纖毛;I,花邊星齒蛉幼蟲體表呼吸結構;J,花邊星齒蛉幼蟲胸部體表呼吸結構;K,花邊星齒蛉幼蟲氣管腮;L,花邊星齒蛉幼蟲中胸氣門;M和N,花邊星齒蛉幼蟲1-2腹節氣門;O,花邊星齒蛉幼蟲毛簇;P,花邊星齒蛉幼蟲毛簇纖毛。簡稱:As,腹部氣門;Ts,胸部氣門;Tg,氣管鰓;Tgt,毛簇;Tr,氣管;Fi,毛簇纖毛。Note:A,surface respiratory structures in abdomen of P.xanthodes larva;B,surface respiratory structures in thorax of P.xanthodes larva;C,tracheal gill of P.xanthodes larva;D,spiracle in mesothorax of P.xanthodes larva;E and F,spiracle in 1～2 abdominal segment of P.xanthodes larva;G,tracheal gill tuft of P.xanthodes larva;H,tracheal gill tuft filaments of P.xanthodes larva;I,surface respiratory structures in abdomen of P.costalis larva;J,surface respiratory structures in thorax of P.costalis larva;K,tracheal gill of P.costalis larva;L,spiracle in mesothorax of P.costali larva;M and N,spiracle in 1～2 abdominal segment of P.costalis larva;O,tracheal gill tuft of P.costalis larva;P,tracheal gill tuft filaments of P.costalis larva.Abbreviations:As,abdominal spiracle;Ts,thoracic spiracle;Tg,tracheal gill;Tgt,tracheal gill tuft;Tr,trachea;Fi,filament.

3 結論與討論

COⅠ基因被廣泛用于昆蟲的系統地位和系統發育研究，是DNA條形碼選用的主要基因之一，可在昆蟲生長發育的不同階段對其進行鑒定(陳珊等，2017)。本研究發現，湘西峒河流域星齒蛉幼蟲的COⅠ基因片段分別與花邊星齒蛉和炎黃星齒蛉COⅠ基因一致性最高。后續的遺傳距離分析發現，花邊星齒蛉種團和炎黃星齒蛉范圍內的種間遺傳距離為0.060～0.106，而P001、P002、P003與花邊星齒蛉的遺傳距離不超過0.033，低于種間遺傳距離；P004、P005與炎黃星齒蛉的遺傳距離也低于種間遺傳距離，由此推測P001、P002和P003屬于花邊星齒蛉，P004和P005屬于炎黃星齒蛉。為了驗證遺傳距離分析結果，本研究用齒蛉亞科昆蟲3屬(星齒蛉屬、齒蛉屬和巨齒蛉屬)的COⅠ基因構建了系統發育樹，COⅠ基因片段的分支情況與屬級分類地位一致。Jung等(2016)使用魚蛉科和齒蛉科昆蟲COⅠ基因片段構建的系統發育樹分支也得到了與本研究類似的結果，各分支與物種的屬級分類地位一致，來自同一物種的COⅠ基因聚為一支。P001、P002和P003與花邊星齒蛉聚為一支，P004和P005與炎黃星齒蛉聚為一支，該結果進一步證實峒河流域采集的星齒蛉幼蟲分別屬于花邊星齒蛉和炎黃星齒蛉。

花邊星齒蛉和炎黃星齒蛉為我國廣布種。花邊星齒蛉主要分布于東洋界，分布范圍包括云南、貴州、湖北、湖南、江西、安徽、浙江、福建、廣西、廣東和臺灣，在河南商城也有發現(Liuetal.,2007)。炎黃星齒蛉分布范圍涵蓋東洋界和古北界，包括遼寧、北京、河北、山西、山東、甘肅、陜西、云南、貴州、四川、重慶、河南、湖南、湖北、江西、安徽、浙江、廣西和廣東(Liuetal.,2006)。本研究的野外采集發現，洽比河、司馬河和丹青河兩種星齒蛉均有分布，峒河干流和龍午河僅發現花邊星齒蛉。丹青河水量充沛，上游位于高望界國家級自然保護區。該保護區自然環境優越，人類活動干擾小，動植物多樣性極高，保護區生物多樣性對保持丹青河星齒蛉多樣性可能有積極作用。峒河干流流經矮寨鎮和吉首市區，河流沿線居民區和工農業設施較多，部分河段存在嚴重的污染問題(朱程等，2010)。人類活動引起的水質污染可能是峒河干流星齒蛉數量少和種類單一的重要原因。龍午河是峒河較小的一條支流，干流長度不足20 km，在枯水季節常常出現斷流；花邊星齒蛉在龍午河種群數量較大，但未發現炎黃星齒蛉。因此推測，河水干枯可能是影響龍午河星齒蛉多樣性的重要因素，花邊星齒蛉可能比炎黃星齒蛉更能適應河水斷流的自然情況。花邊星齒蛉和炎黃星齒蛉在洽比河和司馬河均有分布。洽比河和司馬河上游位于保靖縣呂洞山區，呂洞山被苗區人民稱為圣山，自然環境優越，人類活動干擾較小(劉曉蓉，2018)。綜上，河流污染和斷流可能是影響星齒蛉種群數量的重要因素，水量充沛、水質清潔的河流更有利于星齒蛉生存。

水生昆蟲由陸生昆蟲演化而來，因此水生昆蟲均保留了氣管呼吸系統(Lee,1929;鄭霞林等，2008)。齒蛉科包括齒蛉屬和星齒蛉屬，它們的幼蟲均為淡水生，具有發達的氣管呼吸系統。曹成全等(2010)研究齒蛉屬普通齒蛉Neoneuromusignobilis幼蟲的呼吸系統，發現普通齒蛉具有兩條較粗的側縱干氣管，側縱干氣管分支而來的二級氣管與氣門、毛簇相連。本研究在星齒蛉屬幼蟲上也觀查到了氣管呼吸系統，花邊星齒蛉體表的10個氣門均與氣管相連，毛簇、氣管鰓和臀足側突中均具有氣管；對炎黃星齒蛉和花邊星齒蛉毛簇的觀察還發現，毛簇基部具有大量微氣管，這些微氣管從毛簇纖毛的基部向上延伸，一直到達纖毛的端部。Barclay等(2005)使用掃描電鏡觀測了新齒蛉屬昆蟲C.cornutus毛簇纖毛橫切面，發現C.cornutus毛簇纖毛的主體是貫穿其中的微氣管，微氣管螺旋狀內脊使纖毛具有足夠的剛性抵抗水壓；同時纖毛表面具有密集的褶皺，這些褶皺增加了纖毛與水的接觸面積，有利于纖毛與水介質的氣體交換。齒蛉亞科幼蟲毛簇還與一條收縮肌相連，可以有節律的擺動，以促進毛簇與水介質的氣體交換(Bitsch,2012)。炎黃星齒蛉和花邊星齒蛉幼蟲的毛簇在水中也會進行這樣的擺動。本研究推測，星齒蛉與齒蛉類似，纖毛中的微氣管使纖毛在水壓下保持貫通，水介質中溶解的氧氣能夠穿過纖毛進入微氣管，然后通過氣管系統傳遞到整個蟲體。對花邊星齒蛉氣管鰓和臀足側突的觀察發現，這些結構中具有一條比纖毛微氣管略粗的氣管。由此推測，氣管鰓和臀足側突也具有氣體交換的功能，但呼吸效率遠不如毛簇。綜上，本研究認為星齒蛉幼蟲在水下主要通過毛簇纖毛獲取水中的氧氣，毛簇是星齒蛉幼蟲在水下呼吸的主要結構。