不同方法對紅火蟻社會型鑒定效果的比較

王晨軒，賈羚藝，李天楚，陳 立，黃大衛,,4*

(1.河北大學生命科學學院，河北省動物系統學與應用重點實驗室，河北保定 071002；2.中國科學院動物研究所動物進化與系統學院重點實驗室，北京 100101；3.中國科學院動物研究所農業蟲害鼠害綜合治理研究國家重點實驗室，北京 100101；4.南開大學生命科學學院，天津 300350)

紅火蟻SolenopsisinvictaBuren，膜翅目蟻科，是一種社會性昆蟲，有多個品級，包括蟻后、有生殖能力的雌蟻、雄蟻，以及無生殖能力的工蟻。紅火蟻原產于南美洲，后傳入美國、澳大利亞、新西蘭，乃至亞洲的諸多國家和地區，例如中國大陸、臺灣、香港、澳門、菲律賓、泰國、馬來西亞等(董慧和楊定，2005)。該物種擴散能力極強，具有很強的攻擊性，是世界上最成功的入侵性螞蟻之一(Tschinkel，2006)，可在農業和林業的生產、生態平衡，以及公共安全等方面產生巨大危害(Vinson，2013)。

紅火蟻具有單蟻后(Monogyne)和多蟻后(Polygyne)兩種社會型，單蟻后型巢穴僅具有一只可繁殖蟻后，多蟻后型巢穴中具有兩只及以上可繁殖蟻后。紅火蟻自2004年在中國大陸被發現后，疫情嚴重，傳播廣泛(陸永躍和曾玲，2015)。在紅火蟻傳播過程中，其社會型格局可在同一地區的不同時間發生動態變化，不同地區間社會型格局也不相同。不同社會型的紅火蟻在行為、種群結構、擴張速度等方面存在較大差異，因此鑒定社會型是對紅火蟻制定有效監控方案的關鍵步驟(邵敬國等，2008)。

關于紅火蟻兩種社會型產生的機制已有較為深入的研究，紅火蟻已日漸成為研究螞蟻類群社會結構的模式物種。Gp-9基因對紅火蟻巢穴中工蟻是否接納蟻后有著很大影響(Ross，1997)。單蟻后在該基因位點是純合子，僅擁有Gp-9B等位基因，而多蟻后型是雜合子，擁有Gp-9B和Gp-9b兩個等位基因。不同社會型由Gp-9基因的等位基因決定，b等位基因與紅火蟻多蟻后社會型有密切關系(Ross，1998)。對Gp-9進行測序后，發現該基因編碼了一種信息素結合蛋白，該蛋白與工蟻能否接受純合子蟻后或雜合子蟻后相關(Ross，2002)。

單蟻后巢穴中，基因型為BB的雌蟻與基因型為BB的雄蟻婚飛交配后，產生后代均為BB型。單蟻后巢穴產生的BB型雌蟻個體較大，婚飛后能夠獨立建立新巢，并培育第一代工蟻。多蟻后巢穴中的Bb型蟻后會產生BB、Bb和bb 3種基因型后代，其中bb型工蟻或蟻后壽命很短；BB型雌蟻體型比單蟻后巢穴中的BB型雌蟻小，短距離婚飛后無法獨自建立新巢，最終回歸舊巢或加入其它多蟻后巢穴，但會逐漸被Bb型工蟻殺死(DeHeer，1999；Huang and Wang，2014)，而Bb型蟻后傾向回歸舊巢進行繁殖(Krieger，2005)，最終導致Bb基因型占多蟻后型巢穴基因型的90%左右，因此多蟻后型巢顯示雜合子基因型(Ross，1997)。

單蟻后種群與多蟻后種群除蟻后數目和身體大小不同之外，還有諸多特征表現出明顯差異。多蟻后型蟻巢較小且蟻群密度大，繁殖能力強(Rossetal.，1999)，具有更強的種間競爭力(Porteretal.，1988)，因此多蟻后型能夠更好的適應入侵環境，建立新的生態平衡(Porter and Savignano，1990)。高密度多蟻后型巢穴增加了防治頻次和成本(Greenbergetal.，1992)。雖然已經有鑒定紅火蟻種群的社會型方法報道，但缺乏一套可重復性高且操作便捷的標準化鑒定方法。

紅火蟻的巢穴密度、外形及行為等特征可以初步判斷紅火蟻的社會型。多蟻后型紅火蟻與單蟻后型紅火蟻相比，工蟻體型較小，數量較多。多蟻后型紅火蟻巢穴之間相鄰較近，蟻巢密度較大。當多蟻后型的工蟻遭遇同種個體的入侵時，無論入侵者來自單蟻后型巢穴，還是來自于多蟻后型巢穴，都沒有很強的攻擊性，而單蟻后型的工蟻與之相反，對同種個體入侵的防范意識更強(Fritz and Meer，2003)。依據這些生物學特征，可以簡單的對紅火蟻的類型進行區分，但是生物學觀察法容易出現因觀察不詳細或小樣本量對統計造成的誤差產生判斷錯誤。利用PCR(Polymerase Chain Reaction)等分子生物學手段，能夠達到更好的鑒定效果。Gp-9基因位于紅火蟻基因組的低重組區域，通過對紅火蟻15種Gp-9基因的比較，發現該基因在紅火蟻類群中十分保守，編碼區在不同物種間僅涉及點突變的變異(Krieger and Ross，2005)。因此可以通過對該基因及附近區段的DNA序列設計特異引物，利用PCR擴增和凝膠電泳等手段驗證紅火蟻DNA樣品中是否含有Gp-9等位基因B或b，進而判斷紅火蟻種群的社會型。

基于PCR的鑒定方法，已有大量研究報道了不同的引物或方法對紅火蟻社會型的鑒定效果，受到了國內外學者的青睞(Chenetal.，2006;Goodismanetal.，2007;Laietal.，2008;Yangetal.，2008;Yangetal.，2009;Allenetal.，2010;Garlapatietal.，2010;Laietal.，2010;Linetal.，2010;Chirinoetal.，2012;Laietal.，2012;Yangetal.，2012;Chenetal.，2014;Kelly and Sellers，2014;Laietal.，2015;Kayetal.，2018)。目前已有多種針對Gp-9序列設計的引物，可以通過PCR對紅火蟻的Gp-9基因型進行鑒定。本文以中國紅火蟻為材料，選取7對不同的特異引物進行PCR擴增，并對比不同種類的DNA聚合酶在實驗中的擴增效果，從而比較實驗結果的準確性和重復度，篩選出了一套便捷可靠的實驗方案，為鑒定紅火蟻社會型提供了技術參考，以期為紅火蟻的相關研究提供幫助。

1 材料和方法

1.1 樣本采集及生物學指標的測量

實驗所用紅火蟻于2018年7月和9月采集于廣東省廣州市華南農業大學校園和廣州市黃埔區廣州科學城。觀察蟻巢大小及密度后掘土采集螞蟻，待蟻群穩定后使用“滴水浸泡法”將蟻群從土壤中逼出，轉移至飼養盒中，飼養盒為60 cm×44 cm×36 cm的塑料整理箱，整理箱四壁涂有Fluon以防止蟻群逃逸，溫度26℃，濕度60%～70%并提供水、蜂蜜水和黃粉蟲在實驗室飼養。對各巢螞蟻進行生物學觀察，統計每巢中脫翅蟻后的數量。

1.2 基因組DNA提取

本實驗共采用來自華南農業大學校園和廣州科學城不同區域的8巢紅火蟻，每巢分別隨機收集25頭工蟻，使用EasyPure Genomic DNA Kit (TransGen Biotech,Beijing,China)提取基因組DNA，使用NanoDrop-2000 Spectrophotometer (Thermo,Madison,WI,USA)測量DNA濃度和純度。最終保證使用的DNA濃度大于100 μg/μL，OD260/OD280和OD260/OD230均在1.8～2.0。

1.3 PCR擴增反應

由于不同引物所擴增的片段長度不同、引物的退火溫度不同，所以本研究中針對不同的引物，采取不同的PCR程序(表1)。此外，為對比不同DNA聚合酶的擴增效果，對編號為7和8的紅火蟻樣品，針對相同的引物(多重PCR技術的引物，表1)使用不同的DNA聚合酶進行擴增。共選取4種DNA聚合酶(表2)：(1)兩種不同廠家的熱啟動高保真酶：Platinum? Taq DNA polymerase (Invitrogen,Carlsbad,USA)，TransStart? Taq DNA Polymerase (TransGen Biotech,Beijing,China)。(2)兩種不同廠家的高保真酶：TransTaq? DNA Polymerase High Fidelity (TransGen Biotech,Beijing,China)，KOD DNA Polymerase (Toyobo,Osaka,Japan)。

1.4 凝膠電泳檢測及限制性內切酶檢測

PCR產物使用1%凝膠電泳檢測后，選擇單蟻后型和多蟻后型PCR產物使用限制性內切酶HindIII (NEB,Beijing,China)，按照使用說明進行酶切，檢測條帶大小。

2 結果與分析

2.1 紅火蟻的生物學觀察

通過一定時間的觀察，發現8號紅火蟻巢中工蟻體型較大，且僅發現一個脫翅蟻后。編號1-7巢中可發現兩個及以上脫翅蟻后，編號1-7較編號8巢中工蟻體型小。因此通過形態特征鑒定推測蟻巢8中的紅火蟻為單蟻后型，其他7巢為多蟻后型。

2.2 不同引物擴增紅火蟻 Gp-9 基因的結果

以紅火蟻DNA為模板，用7對特異引物進行擴增，經凝膠電泳檢測(圖1)可見多重PCR技術(圖1A)條帶清晰，單蟻后型與多蟻后型結果區別明顯，重復性較高(成功率0.86，n=7)。對其PCR產物進行酶切之后(圖1B)，多蟻后型顯示兩條大小不一的條帶，單蟻后型帶型不發生改變。針對b等位基因的一種方法(圖1C，D)可在多蟻后型樣品中擴增出單一條帶(分別為219 bp 和259 bp)，單蟻后型無條帶，重復性較高(成功率1.00，n=7)。對2013年報道的4對同時擴增B、b等位基因的引物(Wangetal.，2013)進行實驗(圖1E-H)，發現4對引物的成功率均較低，或擴增條帶不清晰，容易出現雜帶，對實驗判斷造成影響。其中圖1G對應的引物，雖然可獲得清晰條帶，但是重復性較低(成功率0.43，n=7)。

表1 引物及其程序設定Table 1 Primers and PCR program settings

表2 DNA聚合酶Table 2 DNA polymerases

圖1 應用 Gp-9等位基因檢測紅火蟻的社會型Fig.1 Gp-9 banding patterns of social forms of Solenopsis invicta注：實驗中各引物PCR擴增結果及條帶大小見電泳圖；M，DNA Marker；1,2,3,4,5,6,7,8蟻巢編號；A，多重PCR技術；B，對 Gp-9B-specific 26BS 16BAS，Gp-9b-specific:24bS 25bAS引物PCR擴增產物的酶切鑒定；C，D，Gp-9b 等位基因擴增法；E-H，其他同時擴增B、b等位基因的引物；所使用的DNA聚合酶均為Invitrogen公司生產的熱啟動酶Platinum? Taq DNA polymerase。Note:PCR amplification of each pair of primer in the experiment and their sizes were shown in electrophoresis.M,DNA Marker;1,2,3,4,5,6,7,8 Nest numbers;A,Multiplex PCR,B,Enzyme digestion of PCR amplification products of Gp-9B-specific 26BS 16BAS and Gp-9b-specific 24bS 25bAS primers;C,D,Gp-9b allele amplification;E-H,other primers that simultaneous amplification of B and b alleles;All the PCR were conducted using Platinum? Taq DNA polymerase,Invitrogen.

2.3 不同DNA聚合酶擴增紅火蟻 Gp-9基因的結果

以兩巢紅火蟻的DNA為模板，使用相同引物(多重PCR技術的引物Gp-9B-specific:26BS 16BAS，Gp-9b-specific:24bS 25bAS)，在相同的PCR反應體系和擴增程序(表1)下，分別用4種不同的DNA聚合酶(表2)進行擴增，以對比不同DNA聚合酶在驗證紅火蟻社會型PCR實驗中的效果。經凝膠電泳檢測發現4種酶的擴增效果具有明顯差別：高保真酶TransTaq? DNA Polymerase High Fidelity擴增產物無可檢出的電泳條帶(圖2A)；熱啟動酶Platinum? Taq DNA polymerase擴增效果明顯優于其他酶，基本沒有引物二聚體產生，電泳帶型易于區分單蟻后多蟻后，單蟻后型為單一條帶，多蟻后型為兩條條帶(圖2B)；熱啟動酶TransStart? Taq DNA Polymerase擴增產物中有非特異擴增的雜帶(圖2C)；KOD DNA Polymerase酶擴增產物的電泳條帶較亮，說明產物的DNA量較高，此外條帶較寬，無法區分相鄰帶型，且條帶大小與預期不符，說明有大量非特異擴增(圖2D)。由此可見，所對比的4種DNA聚合酶中，熱啟動酶Platinum? Taq DNA polymerase最為適用。

圖2 利用多重PCR技術引物和使用不同DNA聚合酶對兩種社會型紅火蟻的擴增結果Fig.2 Identification of two different social forms of Solenopsis invicta Buren by Multiplex PCR using different DNA polymerases.注：M，DNA Marker；7和8，蟻巢編號，分別為多蟻后型和單蟻后型；圖A，用酶TransTaq? DNA Polymerase High Fidelity擴增結果；圖B，用酶Platinum? Taq DNA polymerase擴增結果；圖C，用酶TransStart? Taq DNA Polymerase擴增結果；圖D，用酶KOD DNA Polymerase擴增結果。Note:M,DNA Marker;7 and 8,nest Numbers,polygyne and monogyne respectively;A,results of PCR using TransTaq DNA Polymerase High Fidelity;B,results of PCR using Platinum? Taq DNA polymerase;C,results of PCR using TransStart Taq DNA Polymerase;D,results of PCR using KOD DNA Polymerase.

3 結論與討論

自紅火蟻社會型分化的調控機制報道以來，針對Gp-9位點的PCR分子鑒定手段有很多。本研究基于這一背景進行了各種方法之間的比較，選取了7對具有代表性的引物以及4種DNA聚合酶進行對比，并最終獲得了實驗室內鑒定紅火蟻社會型的最佳實驗方案。

通過比較7對引物的實驗可行性及重復性，本研究發現其中4對同時擴增B、b等位基因的引物因重復性較差或擴增條帶特異性不高(圖1E-H)，不利于紅火蟻社會型的實驗鑒定。而多重PCR技術與Gp-9b等位基因擴增(圖1A-D)的準確率較高，重復性較強。在多重PCR技術最早的報道中，Valles and Porter (2003)提出可以將PCR產物進行限制性酶切，從而更易辨別單蟻后型和多蟻后型的條帶。在本研究的實驗中，發現該方法的PCR步驟可同時擴增出大小不一的條帶，分別對應多蟻后型和多蟻后型。其PCR產物經電泳后已經可以清晰的展現不同條帶大小的區別(圖1A)，無需后續的酶切步驟(圖1B)即可用于判斷樣品的社會型。而Gp-9b等位基因擴增的兩種引物(圖1C，D)只能擴增出b等位基因的單一條帶，對B等位基因無擴增效力，是針對b等位基因的特異引物。因此可以將Gp-9b等位基因擴增與多重PCR技術搭配使用，二者的電泳結果可相互印證，共同判別紅火蟻的社會型。

在對不同酶的對比中，本研究所選的4種聚合酶均具有不同強度的保真性，并且這4種酶中還包括兩種熱啟動酶。酶的高保真性主要可以通過兩種手段實現，一種是利用某些特殊的DNA聚合酶本身的保真性，另一種是將普通DNA聚合酶與具有外切酶活性的其他酶按不同比例混合。因此不同品牌的不同高保真DNA聚合酶產品，其保真效率也不盡相同。在本研究所對比的4種DNA聚合酶中，四者均具有高保真功能。其中高保真酶TransTaq?DNA Polymerase High Fidelity同時具有5′ → 3′的外切酶活性和3′ → 5′的外切酶活性，保真效果最好，錯配率最低，用該酶進行紅火蟻社會型的PCR鑒定，沒有擴增出預期條帶。引物序列與待測樣品的序列結合并非完全一致，不能滿足此類高保真DNA聚合酶的擴增條件。另外，KOD DNA Polymerase酶使用了自然菌株(超嗜熱原始菌ThermococcuskodakaraensisKOD1株)的DNA聚合酶，該酶具有天然的3′ → 5′的外切酶活性，但活性較其他混合高保真酶類更弱，因此非特異擴增產物較多，不適用于紅火蟻的社會型鑒定。

而熱啟動DNA聚合酶的工作原理主要是通過對酶進行化學修飾、加入酶抗體或其他特異蛋白等手段，減少低溫下DNA聚合酶發生鏈錯配或產生引物二聚體。本研究所對比的4種DNA聚合酶中，有兩種具有熱啟動功能，其中熱啟動酶Platinum?Taq DNA polymerase擴增效果優于熱啟動酶TransStart?Taq DNA Polymerase，其原因可能來自各個方面，例如保真酶的成分和比例、熱啟動的原理不同等等。而與其他3種酶比較，Platinum?Taq DNA polymerase的效果也為最佳，這可能與其適中的保真性和較強的熱啟動功能有關，該酶在對紅火蟻社會型的PCR鑒定中較為適用。

針對本研究所采集的8個蟻巢，生物學形態鑒定結果中僅編號8巢有單只脫翅蟻后，Gp-9b等位基因擴增和多重PCR技術所獲得的鑒定結果與生物學觀察所得結果相互驗證，彌補了生物學觀察所帶來的缺陷，最終表明1-7號巢為多蟻后型巢穴，而只有8號巢穴為單蟻后型。這表明Gp-9b等位基因擴增和多重PCR技術的分子鑒定結果十分可靠，且重復率高，可以與生物學觀察一同用于判定紅火蟻的社會型。

除了本研究所采用的基于PCR的分子鑒定法外，紅火蟻的社會型的判斷還有其他方法，例如蛋白質電泳法、探針法等。蛋白質電泳法(DeHeer，1999)利用Gp-9B蛋白與Gp-9b蛋白的遷移速率不同這一原理，根據蛋白電泳條帶判斷Gp-9的基因型，從而判斷紅火蟻的社會型。但是蛋白質電泳對提取樣品有較高的要求，必須采集活體螞蟻且每個樣本所需螞蟻數目較大，加之蛋白質電泳技術本身的復雜性和不穩定性，因此此方法并不適于快速鑒定紅火蟻社會型。探針法利用與Gp-9基因結合的引物和探針檢測Gp-9基因型(Ascunceetal.，2010)，有較高的靈敏度，但該方法所需探針較為昂貴，且實驗流程繁瑣，需配備熒光定量PCR儀，不適合在所有實驗室普及。

此外還有多種PCR與其他實驗手段相結合的方法，例如RFLP法(Restriction Fragment Length Polymorphism) (Lucasetal.，2015)，該方法需設計多對引物進行巢式PCR，且擴增片段較長(2 kb)，增加了實驗的難度，此外RFLP操作繁瑣,不適于快速檢測紅火蟻社會型。而HRM(高分辨率熔解曲線)法需要借助實時熒光定量PCR完成實驗(Oakeyetal.，2011)，實驗操作過于復雜。此外還有人提出可以利用紅火蟻cDNA擴增Gp-9序列，但該方法需要進行紅火蟻RNA的提取和cDNA的逆轉錄(Leal and Ishida，2008)，增加實驗步驟。

由此可見，上述不同方法因為實驗步驟繁瑣、成本較高，或需要特殊的實驗儀器等原因并不適用于所有實驗室。與其對比之下，本研究篩選出的多重PCR技術與Gp-9b等位基因擴增相結合的PCR鑒定方案對螞蟻樣品的要求較低，只需使用酒精浸泡的工蟻樣本，就可通過簡單的DNA提取步驟獲得實驗所需DNA樣品。此外，基于PCR的技術簡單易行，具備常規分子生物學器材配備的實驗室均能操作，實驗耗時短，通常可在2～3 h內批量完成多個不同巢穴的鑒定試驗，更適用于普通實驗室對紅火蟻社會型的鑒定。

綜上所述，本文提出一套針對紅火蟻社會型鑒定的組合方案——將多重PCR技術，Gp-9b等位基因擴增這兩種分子生物學方法相結合，利用具有中等保真性能和較強熱啟動效率的DNA聚合酶進行PCR擴增，并輔以生物學觀察的手段進行鑒定，通過這三者實驗結果的相互驗證，能更好的判斷中國紅火蟻種群的社會型。