馬鈴薯瓢蟲與茄二十八星瓢蟲SCAR標記的建立及應用

郭木娟，陳詩敏，庾家琪，葉翠怡，邱寶利，李文香，潘慧鵬*

(1.華南農業大學農學院/廣東省生物農藥創制與應用重點實驗室/廣東省農業害蟲生物防治工程技術研究中心，廣州 510642；2.河北北方學院農林科技學院，河北張家口 075000)

馬鈴薯瓢蟲Henosepilachnavigintioctomaculata(Motschulsky)和茄二十八星瓢蟲Henosepilachnavigintioctopunctata(Fabricius)均被稱為二十八星瓢蟲，屬鞘翅目瓢蟲科。馬鈴薯瓢蟲以成蟲越冬，多分布在我國北方地區，其成蟲體形為半球形、赤褐色，各鞘翅上均具有14個黑斑(郭文英等，2005)，其主要為害的經濟作物有馬鈴薯、茄子、番茄及辣椒等茄科蔬菜，但以危害馬鈴薯為主(高芳瑞，2018)。茄二十八星瓢蟲的外形與馬鈴薯瓢蟲相似度極高，危害的農作物種類也幾乎相同，但茄二十八星瓢蟲以危害茄子為主，分布的范圍更為廣泛(張曉寧和歐曉紅，2010)。兩種瓢蟲的幼蟲及成蟲均以葉片為食，初孵幼蟲主要群集于葉片背面取食葉肉，幼蟲稍大后擴散危害，受害葉片通常形成不規則透明斑或穿孔，后期變為褐色凹陷斑痕。此外，嫩莖、花瓣、萼片、果實等也會受其危害，導致植株產量下降、果實品質不佳或植株枯死，嚴重影響馬鈴薯、茄子等農作物的經濟價值(宋萍等，2008；王婧瑜等，2018)。

雖然有文獻提出利用二十八星瓢蟲外表形態在細微結構上的區別來鑒定馬鈴薯瓢蟲與茄二十八星瓢蟲的方法(王波，2012)，但是這兩種害蟲外部形態的區分對于非昆蟲分類專業人員來說仍比較困難。近幾年來，隨著氣候變暖、貿易發展及種植業結構的調整，馬鈴薯瓢蟲和茄二十八星瓢蟲的危害越發嚴重，發生范圍有擴大蔓延的趨勢(Lüetal.,2019)。然而這兩種二十八星瓢蟲經常被人們混為一談，導致難以制定針對性的田間防治方案，因此尋找一種能快速區分馬鈴薯瓢蟲及茄二十八星瓢蟲的方法十分有必要。

序列特征擴增區域(sequence characterized amplified regions,SCAR)是基于隨機擴增多態性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)發展而來，經過對RAPD標記技術所擴增的目的片段進行克隆、測序并分析序列，而后根據測序結果設計出來的穩定性標記(黃茜等，2016)。Paran等(1993)首次提出SCAR標記技術后，近二十多年來SCAR標記技術被廣泛地應用于不同研究領域。其中，在昆蟲的種類鑒定方面也被廣泛應用，例如，王金娜等(2012)利用SCAR標記技術篩選出能準確鑒定溫室白粉虱Trialeurodevaporariorum的特異性引物；孟祥欽等(2010)通過SCAR標記技術確立了快速鑒定西花薊馬Frankliniellaoccidentalis的分子生物學方法。與其它分子標記方法相比，SCAR標記具有穩定性高、操作簡便、特異性強等優點(馬麗娜等，2017)。

本研究通過對馬鈴薯瓢蟲及茄二十八星瓢蟲進行RAPD擴增，找到兩種二十八星瓢蟲中具有的特異性擴增條帶后，通過切膠回收、克隆及測序后設計SCAR標記引物，從而在分子水平上建立快速區分馬鈴薯瓢蟲和茄二十八星瓢蟲的方法，該鑒定方法高效便捷，且對二十八星瓢蟲的田間精準性防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試蟲

馬鈴薯瓢蟲2018年5月采于河北省張家口北方學院的教學基地，經形態學鑒定，確定為馬鈴薯瓢蟲；茄二十八星瓢蟲2018年4月采自華南農業大學校園內的龍葵上，經形態學鑒定，確定為茄二十八星瓢蟲。

1.2 供試試劑

隨機引物采用生工生物工程(上海)股份有限公司的RAPD通用引物系列，分別為OPH、OPI、OPJ，每個系列的引物各20條。特異性引物合成以及DNA序列測序均委托廣州擎科生物技術有限公司完成。PCR擴增中所用到的2XPCR Taq MasterMix購自abm生物科技有限公司，DNA提取所用試劑盒、DNA純化回收所用的試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司、克隆試劑盒購自TAKARA生物技術有限公司；DNA標準Maker購自深圳輝諾生物科技有限公司。

1.3 單頭馬鈴薯瓢蟲與茄二十八星瓢蟲DNA提取

單頭馬鈴薯瓢蟲與茄二十八星瓢蟲成蟲DNA提取使用DNA提取試劑盒，DNA濃度用微量核酸濃度測定儀測定，放置-20℃保存備用。

1.4 RAPD擴增

分別以兩種二十八星瓢蟲的DNA溶液作為模板，利用合成的60條隨機引物進行PCR擴增，兩種瓢蟲分別設置4個重復，以確保篩選出穩定的特異性條帶。PCR擴增體系為20 μL，其中包括6 μL ddH2O、10 μL 2XPCR Taq MasterMix、1 μL DNA模板及3 μL RAPD引物(10 mM)。PCR反應程序為：首先進行94℃預變性4 min，之后進行40個循環(包括94℃變性1 min、37℃退火50 s、72℃延伸95 s)，最后72℃延伸10 min。PCR程序反應完成后，從各樣品的PCR擴增產物中吸取5 μL 于1%瓊脂糖凝膠上進行電泳(120 V,20 min)，并利用凝膠成像分析儀對結果進行分析，明確特異性擴增的條帶。

1.5 特異性擴增產物的回收克隆

對經RAPD擴增后在兩種二十八星瓢蟲中獲得的特異性條帶，采用DNA純化回收試劑盒對其進行純化回收。然后使用克隆試劑盒，根據說明書步驟，將純化回收的目的片段連接到PMD-18T載體上，并轉化到JM109感受態細胞中，37℃過夜培養，挑白色陽性克隆于10 μL ddH2O中作為模板，利用通用引物M13(F:5′-CGCCAGGGTTT TCCCAGTCACGAC-3′,R:5′-CACACAGGAAACAG CTAT-3′)進行PCR擴增驗證目的條帶，根據電泳結果確定目的條帶成功連接到PMD-18T載體上后，將具有目的條帶的模板加入5 mL含Amp的LB培養基中過夜振蕩培養(200 rpm,37℃)，將菌液送廣州擎科生物技術有限公司進行測序。

1.6 SCAR引物設計及PCR擴增

基于測序結果，在https://sg.idtdna.com/Primerquest/Home/Index網頁上設計SCAR標記特異性引物，并利用所提取的馬鈴薯瓢蟲與茄二十八星瓢蟲的DNA作為模板，驗證所設計引物的特異性。PCR反應體系為20 μL，其中包括去離子水7 μL、2XPCR Taq MasterMix 10 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL及DNA模板1 μL。PCR反應程序為：首先進行94℃預變性3 min，之后進行35個循環(包括94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min)，最后72℃延伸10 min。擴增反應在PCR儀上進行，反應產物同樣使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

2 結果與分析

2.1 RAPD擴增

在60條隨機引物中，引物OPI-6(AAGGCGGCAG)在馬鈴薯瓢蟲中擴增到一條約為750 bp的條帶，而在茄二十八星中沒有擴增到此大小的條帶；另外，引物OPJ-15(TGTAGCAGGG)在茄二十八星中擴增到一條約為750 bp的條帶，而在馬鈴薯瓢蟲中沒有擴增到此大小的條帶。圖1顯示了OPI-6在馬鈴薯瓢蟲與茄二十八星瓢蟲中的隨機擴增結果圖譜，圖2顯示了OPJ-15在馬鈴薯瓢蟲與茄二十八星瓢蟲中的隨機擴增結果圖譜。

圖1 引物OPI-6在兩種二十八星瓢蟲中的RAPD擴增圖譜Fig.1 RAPD amplification profiles in two 28-spotted ladybeetles with primer OPI-6注：M，2 000 bp分子量標準；1-4，馬鈴薯瓢蟲；5-8，茄二十八星瓢蟲。Note:M,2 000 bp marker;1-4,H.vigintioctomaculata;5-8,H.vigintioctopunctata.

圖2 引物OPJ-15在兩種二十八星瓢蟲中的RAPD擴增圖譜Fig.2 RAPD amplification profiles in two 28-spotted ladybeetles with primer OPJ-15注：M，2 000 bp分子量標準；1-4，馬鈴薯瓢蟲；5-8，茄二十八星瓢蟲。Note:M,2 000 bp marker;1-4,H.vigintioctomaculata;5-8,H.vigintioctopunctata.

2.2 SCAR引物擴增

對經RAPD擴增在兩種瓢蟲中分別得到的特異性條帶進行DNA切膠回收、克隆并測序后(表1)，根據測序得到的片段設計了兩對SCAR引物，分別為OPI-6 test F:5′-CGTCTCGGGTCTAGAG AT-3′,OPI-6 test R:5′-GACATACCGCCCGATTAG-3′和OPJ-15 test F:5′-GGTATGGAGTATCACCAAT-3′,OPJ-15 test R:5′-ATTCCTCCGTATCTCTTTC-3′。經過PCR及凝膠電泳檢測，確定根據OPI-6 test的測序結果所設計的SCAR引物僅能在馬鈴薯瓢蟲中擴增出大小為645 bp的條帶，而根據OPJ-15 test的測序結果所設計的SCAR引物僅能在茄二十八星瓢蟲中擴增出大小為436 bp的條帶。

2.3 SCAR引物靈敏度檢測

經微量核酸濃度測定儀檢測，單頭馬鈴薯瓢蟲DNA濃度為146.4 ng/μL，單頭茄二十八星瓢蟲DNA濃度為300.4 ng/μL，將這兩種DNA溶液均依次稀釋10倍作為模板，在馬鈴薯瓢蟲中選取OPI-6 test引物，在茄二十八星瓢蟲中選取OPJ-15 test引物，進行PCR擴增和檢測，結果表明當馬鈴薯瓢蟲DNA濃度稀釋到103倍時仍能檢測到目的擴增條帶，而茄二十八星瓢蟲DNA濃度稀釋到104倍時仍可以檢測到目的擴增條帶，引物靈敏度分別達到0.1464 ng/μL和0.03004 ng/μL。圖4顯示了OPI-6 test在馬鈴薯瓢蟲不同稀釋倍數DNA中的擴增結果，圖5顯示了OPJ-15 test在茄二十八星瓢蟲不同稀釋倍數DNA中的擴增結果。

圖3 兩對SCAR引物在兩種二十八星瓢蟲中的擴增圖譜Fig.3 The amplification profiles of two pairs of SCAR markers in the two 28-spotted ladybeetles注：M，2 000 bp分子量標準；1-2，OPI-6 test(1，馬鈴薯瓢蟲；2，茄二十八星瓢蟲)；3-4，OPJ-15 test(3，馬鈴薯瓢蟲；4，茄二十八星瓢蟲)。Note:M,2 000 bp marker;1-2,OPI-6 test (1,H.vigintioctomaculata;2,H.vigintioctopunctata);3-4,OPJ-15 test (3,H.vigintioctomaculata;4,H.vigintioctopunctata).

圖4 OPI-6 test引物在馬鈴薯瓢蟲不同稀釋倍數DNA中擴增結果Fig.4 Amplification of Henosepilachna vigintioctomaculata with OPI-6 test under different DNA dilution series注：M，2 000 bp分子量標準；1，單頭馬鈴薯瓢蟲DNA原液146.4 ng/μL；2，DNA濃度稀釋10倍；3，DNA濃度稀釋102倍；4，DNA濃度稀釋103倍；5，DNA濃度稀釋104倍；6，DNA濃度稀釋105倍。Note:M,2 000 bp marker;1,the concentration of original DNA of H.vigintioctomaculata was 146.4 ng/μL;2-6,represents 10-1,10-2,10-3,10-4,10-5 of the original DNA of H.vigintioctomaculata.

表1 OPI-6在馬鈴薯瓢蟲與OPJ-15在茄二十八星瓢蟲中特異性擴增子核苷酸序列Table 1 Nucleotide sequences of the specific amplicons from OPI-6 in Henosepilachna vigintioctomaculata and OPJ-15 in Henosepilachna vigintioctopunctata

圖5 OPJ-15 test在茄二十八星瓢蟲不同稀釋倍數DNA中的擴增結果Fig.5 Amplification of Henosepilachna vigintioctopunctata with OPJ-15 test under different DNA dilution series注：M，2 000 bp分子量標準；1，單頭茄二十八星瓢蟲DNA原液300.4 ng/μL；2，DNA濃度稀釋10倍；3，DNA濃度稀釋102倍；4，DNA濃度稀釋103倍；5，DNA濃度稀釋104倍；6，DNA濃度稀釋105倍。Note:M,2 000 bp marker;1,the concentration of original DNA of H.vigintioctopunctata was 300.4 ng/μL;2-6,represents 10-1,10-2,10-3,10-4,10-5 of the original genomic DNA of H.vigintioctopunctata.

3 結論與討論

本研究共篩選出兩條可用于鑒別馬鈴薯瓢蟲和茄二十八星瓢蟲的RAPD引物，分別為OPI-6和OPJ-15。其中根據OPI-6擴增序列設計的SCAR引物OPI-6 test能在馬鈴薯瓢蟲中擴增出大小為645 bp的條帶，在茄二十八星瓢蟲中無擴增條帶；而根據OPJ-15擴增序列設計的SCAR引物OPJ-15 test能在茄二十八星瓢蟲中擴增到大小為436 bp的條帶，在馬鈴薯瓢蟲中無擴增條帶。馬鈴薯瓢蟲和茄二十八星瓢蟲的SCAR引物在其DNA的濃度很低時，仍能檢測到目的擴增條帶。所以，這兩對SCAR引物能夠準確且靈敏的區分兩種二十八星瓢蟲。

馬鈴薯瓢蟲與茄二十八星瓢蟲均為我國重要的農業害蟲，兩者外形相似度極高，寄主植物也幾乎相同，但對于寄主植物的嗜好不同，且對不同種的化學農藥所表現的抗藥性也不相同(張貴森等，2014；牛建群等，2016)。但目前，對于這兩種瓢蟲的防治，還是簡單粗糙的采用同樣的化學殺蟲劑。隨著近幾年蔬菜種植面積的不斷擴增，二十八星瓢蟲在我國蔬菜種植區頻繁爆發(魏鴻鈞，1995；周雷等，2014)，嚴重影響馬鈴薯、辣椒及茄子等茄科蔬菜的經濟效益。因此，準確區分這兩種二十八星瓢蟲，能夠針對性地制定防治方案。但是，目前只有文獻提出利用外表形態特征的細微差異對馬鈴薯瓢蟲與茄二十八星瓢蟲進行鑒別(虞國躍，2000；張迎春等，2002)，利用該方法對兩種二十八星瓢蟲進行鑒別難度較大，且對于標本的完整程度有較高的要求。本文首次開發了快速鑒別馬鈴薯瓢蟲與茄二十八星瓢蟲的分子生物學方法，該方法操作簡單方便且對標本的完整性無要求，對二十八星瓢蟲的精準防控有重要的意義。

本研究中所設計的兩對SCAR引物在兩種二十八星瓢蟲中的擴增圖譜單一，靈敏度高，且實驗操作簡單方便，鑒別準確且快速，成本較低。所以，該鑒別方法能夠及時監測田間兩種二十八星瓢蟲的發生動態，掌握其發生規律，為制定精準防治方案提供技術支持。