草地貪夜蛾與斜紋夜蛾解毒相關基因的比較分析

朱克森，黃鈞鴻，馮啟理，相 輝

(華南師范大學生命科學學院，昆蟲科學與技術研究所，廣東省昆蟲發育生物學與應用技術重點實驗室&廣州市昆蟲發育與應用技術重點實驗室，廣州 510631)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda(Smith,1797) 屬于鱗翅目Lepidoptera 夜蛾科 Noctuida灰翅夜蛾Spodoptera的一類原產于美洲熱帶和亞熱帶地區的雜食性農業害蟲(Todd and Poole,1980;王振營,2019)，近來入侵我國云南隨后擴散全國呈現出爆發狀態，對我國農業生產構成了極大的危害(吳秋琳,2019;張磊,2019)。草地貪夜蛾寄主植物高達353種，主要包括禾本科的玉米、小麥、水稻、高粱、甘蔗以及棉花、甜菜、甘藍、向日葵、香蕉、甜椒、馬鈴薯、番茄等多種作物(Montezanoetal.,2018)。草地貪夜蛾由于寄主不同也逐漸分化形成了玉米品系和水稻品系2種單倍型，前者主要取食玉米、棉花和高粱，后者主要取食水稻和各種牧草 (Pashleyetal.,1985;Pashleyetal.,1988;Dumas,2015)，這兩種外部形態基本一致，但在寄主植物、交配行為以及性信息素成分等方面具有明顯不同(Pashely,1987;Cruz-Estebanetal.,2018)。

斜紋夜蛾Spodopteralitura(Fabricius)與草地貪夜蛾同為灰翅夜蛾屬農業害蟲，斜紋夜蛾廣泛分布于亞洲、大洋洲、太平洋西岸、中東等許多國家和地區，也是我國重要農業害蟲之一，二者具有較高的生態位重疊，且形態相似，但斜紋夜蛾與草地貪夜蛾存在明顯的食性差異，斜紋夜蛾主要為害雙子葉植物，寄主植物高達389種，包括棉花、煙草、玉米、甘薯、向日葵、高粱、白菜、甘藍、芥菜、茄子、番茄、辣椒、冬瓜以及藜科等多種作物(秦厚國等,2006;趙勝園,2019)。

昆蟲的廣泛性取食與其解毒代謝能力息息相關。在長期侵害過程中，寄主植物與植食性昆蟲發生協同進化，害蟲在廣泛性攝取植物能源的同時，體內強大的解毒代謝防御機制也越漸完善。大多數外源有毒物進入生物體內的解毒過程大致可以分為三個階段，每個階段需要不同的解毒代謝酶參與，第一階段參與的基因家族主要是細胞色素P450(cytochrome P450,P450)，主要將這些親脂性或非極性的異生物素進行氧化，為后續的解毒過程提供底物，第二階段主要是谷胱甘肽轉移酶(glutathione s-transferase，GST)、尿苷二磷酸-糖基轉移酶以及羧酸酯酶等，GST主要催化谷胱甘肽和有毒物質扼合而生產毒性較低的扼合物，第三階段是通過ABC轉運蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC transporter)家族將毒素排出細胞 (Despresetal.,2007;Lietal.,2007;Dermauw and van Leeuwen,2014)。

目前，對于草地貪夜蛾與斜紋夜蛾的解毒代謝相關基因仍未得到系統研究，本研究通過對這兩種夜蛾科害蟲的P450、GST、ABC解毒代謝相關蛋白進行整理與鑒定，以家蠶作為鱗翅目模式生物代表，通過構建系統發育樹進行全基因組水平的分子生物學進化分析。該項研究為探索外來物種的危害程度及提供新型綠色防治策略具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 解毒代謝相關基因的鑒定

從家蠶基因組數據庫(silkworm genome database,SilkDB) (http://silkworm.genomics.org.cn/)下載了家蠶的全基因組序列以及已被注釋的家蠶14 623條蛋白質序列(BGIBMGA000001-BGNBMGA014623)，從NCBI數據庫(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/002/706/865/GCF_002706865.1_ASM270686v1/GCF_00270 6865.1_ASM270686v1_genomic.fna.gz)下載斜紋夜蛾基因組及注釋的基因集；從BIPPA數據庫(https://bipaa.genouest.org/data/public/sfrudb/)下載草地貪夜蛾的全基因組序列及gff3注釋文件信息，通過腳本提取到21 674條蛋白質序列作為基因集；利用已發表的家蠶、斜紋夜蛾、草地貪夜蛾解毒相關蛋白序列如細胞色素P450、ABC轉運蛋白、谷胱甘肽轉移酶作為參考基因序列，以blastp對家蠶、斜紋夜蛾、草地貪夜蛾的注釋基因集中搜索相關蛋白，其中E值設為10-5，所有得到的P450、ABC、GST序列以手動方式進一步在NCBI數據庫逐個blastp確定，對于未確定功能的序列，利用SMART結構域預測平臺 (smart.embl.de/) 進行檢驗和篩選。

1.2 解毒代謝相關基因的系統發育分析以及氨基酸變異位點分析

將最終確定的P450、ABC、GST蛋白序列通過MEGA7.0軟件中的ClustW進行多序列比對，將比對后的文件轉化為nex格式，通過beast 1.10軟件 (Suchardetal.,2018) 使用貝葉斯法構建系統發育樹，其參數chain length為10 000 000，logEvery為1 000，burnin為0.1，選取部分基因顯著擴張的分枝，通過在線軟件PolPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)預測氨基酸變異位點對蛋白質功能影響。

2 結果與分析

2.1 解毒代謝相關基因的注釋與鑒定

對家蠶、斜紋夜蛾、草地貪夜蛾基因組的解毒相關基因進行注釋，并對P450、GST、ABC基因數目做出了統計(表1)。在草地貪夜蛾中鑒定出213個P450細胞色素基因，58個GST谷胱甘肽轉移酶基因，102個ABC轉運蛋白基因；在家蠶鑒定出82個P450細胞色素基因，23個谷胱甘肽轉移酶基因，64個ABC轉運蛋白基因；而在斜紋夜蛾中鑒定出116個P450細胞色素基因，37個谷胱甘肽轉移酶基因，99個ABC轉運蛋白基因，值的注意的是，斜紋夜蛾ABC轉運蛋白有40個未被注釋出來，在進一步確認家族分類的情況下，實際上有1個歸類于亞家族A，有14個歸類于亞家族B，有3個歸類于亞家族C，有2個歸類于亞家族D，有17個歸類于亞家族E，有1個歸類于亞家族F，有1個歸類于亞家族G，僅有1個未歸于某一類亞家族，而這一現象僅出現在斜紋夜蛾中，草地貪夜蛾與家蠶則均被注釋出。統計表明草地貪夜蛾細胞色素P450基因和谷胱甘肽轉移酶基因GST數量發生了顯著擴張現象。

表1 斜紋夜蛾、家蠶與草地貪夜蛾解毒代謝相關基因數目統計Table 1 Statistics on the number of genes related to detoxification metabolism of Spodoptera frugiperda,Spodoptera litura and Bombyx mori

續表1 Continued table 1

注：根據國際通用的P450命名規則，采用CYP前綴表示細胞色素P450，將氨基酸相似性在40%以上的基因劃分為同一個家族,將氨基酸相似性在55%以上的基因劃分為同一個亞家族，以大寫字母表示亞家族，以數字表示一個特定的基因。昆蟲P450基因可以分為4個簇(Clan)，分別為CYP2 clan、CYP3 clan、CYP4 clan及線粒體(Mitochondrion)clan。CYP2簇包括CYP1、CYP2、CYP15、CYP17、CYP18、CYP21、CYP303-307、CYP342和CYP343；CYP3簇包括CYP3、CYP5、CYP6、CYP9、CYP28、CYP308-310、CYP317、CYP321、CYP324、CYP329、CYP332、CYP336-338和CYP345-348；CYP4簇包括CYP4、CYP311-313、CYP316、CYP318、CYP325、CYP340、CYP341和CYP349-352；線粒體CYP簇包括CYP11、CYP12、CYP24、CYP27、CYP49、CYP301、CYP302、CYP314、CYP315、CYP333、CYP334、CYP339和CYP353(Feyereisenetal.,2012)。

2.1.1細胞色素P450鑒定與分析

草地貪夜蛾P450基因簇的4個簇基因個數分別為18、100、72、23，而家蠶和斜紋夜蛾分別含有6，28，35，11和7，49，49，9個，通過比較發現，草地貪夜蛾CYP3和CYP4簇基因數量明顯高于斜紋夜蛾和家蠶，其中主要在CYP3簇里的CYP6、CYP9以及CYP4簇里的CYP4顯著發生了基因家族擴張現象。

對草地貪夜蛾、斜紋夜蛾、家蠶P450基因構建進化樹，絕大部分分支bootstrap值高于90(圖1)。進化樹的分析結果表明，根據P450基因序列的結構和同源性，在進化樹中可聚類為4個簇，同時在進化樹上也表明CYP6、CYP9、CYP4發生了基因家族擴張現象。

選取P450基因家族中的一顯著擴張分支，統計發現草地貪夜蛾共出現7處氨基酸錯義突變位點，經預測極有可能影響蛋白質的功能(表2)。對于每一處位點，錯義突變在草地貪夜蛾中出現的數量與頻率均明顯要高于斜紋夜蛾與家蠶，以氨基酸位點325為例(見圖2)，家蠶中該位置的蘇氨酸(T)替換為斜紋夜蛾和草地貪夜蛾中的甲硫氨酸(M)，暗示T到M的氨基酸突變可能與夜蛾科昆蟲的解毒能力有關，而同為夜蛾科的草地貪夜蛾與斜紋夜蛾相比較下，草地貪夜蛾共有 6個該錯義突變位點的拷貝，遠高于斜紋夜蛾的1個。

圖1 草地貪夜蛾、斜紋夜蛾及家蠶P450的貝葉斯法系統發育樹Fig.1 Bayesian phylogenetic tree of P450 in Spodoptera frugiperda,Spodoptera litura and Bombyx mori注：系統發育樹分枝顏色的深淺代表分值的高低，三角形代表基因顯著擴張部分，陰影區域顏色代表P450基因簇，藍色代表CYP2，淺橙色代表CYP3，紫紅色代表CYP4，淺綠色代表Mito，外層標簽顏色代表物種，紅色為草地貪夜蛾，綠色為斜紋夜蛾，藍色為家蠶。Note:Shaded area color represents P450 gene cluster,blue represents CYP2,on behalf of CYP3 shallow orange,purple on behalf of CYP4,light green represents the Mito,outer label color represents species,Red is S.frugiperda,green is S.litura,and blue is B.mori.

圖2 草地貪夜蛾、斜紋夜蛾和家蠶中P450_cyp6氨基酸的突變位點分析Fig.2 Amino acid replacements of P450_cyp6 in Spodoptera frugiperda,Spodoptera litura and Bombyx mori注：(A) P450_cyp6蛋白質序列對齊。發生錯義突變位點處用紅框標識，數字代表突變氨基酸位置。(B) 基于PolyPhen-2軟件預測第325位氨基酸殘基處的氨基酸替換引起蛋白質功能變化的可能性。家蠶中該位置的蘇氨酸(T)替換為斜紋夜蛾和草地貪夜蛾中的甲硫氨酸(M)。PROBABLY DAMAGING,最高級別可能性。Note:(A) Alignment of Protein sequence of P450_cyp6.(B) Possibility of the amino acid replacement at residue 325 to affect protein function predicted by the PolyPhen-2 algorithm.Threonine (T) in B.mori replaced by methionine (M) in S.litura and S.frugiperda .POSSIBLY DAMAGING,the highest degree of possibility to affect protein function.

表2 草地貪夜蛾、斜紋夜蛾、家蠶 P450_cyp6 基因錯義替換位點統計Table 2 Non synonymous replacements of P450_cyp6 in Spodoptera frugiperda,Spodoptera litura and Bombyx mori

2.1.2谷胱甘肽轉移酶GST鑒定與分析

對草地貪夜蛾、斜紋夜蛾和家蠶GST基因家族進行注釋，分別鑒定出58個、37個以及23個GST基因。系統發育樹分析結果表明(圖3)，與斜紋夜蛾相比，草地貪夜蛾GST基因在部分分支中發生了擴張，存在一支中出現5個或6個GST基因成簇聚集，選取GST基因的一成簇聚集擴張分支出現了5處草地貪夜蛾特有的錯義突變(表3，圖4)，這些突變在斜紋夜蛾、家蠶中僅有一個出現，推測這可能與草地貪夜蛾一些獨特的解毒能力有關。

圖3 草地貪夜蛾、斜紋夜蛾及家蠶 GST 的貝葉斯法系統發育樹Fig.3 Bayesian phylogenetic tree of GST in Spodoptera frugiperda,Spodoptera litura and Bombyx mori注：系統發育樹分枝顏色的深淺代表分值的高低，三角形代表基因顯著擴張部分，外層標簽顏色代表物種，紅色為草地貪夜蛾，綠色為斜紋夜蛾，藍色為家蠶。Note:The shade of the branch color of the phylogenetic tree represents the score,the triangle represents the significantly amplified part of the gene,and the outer label color represents the species.Red is S.frugiperda,green is S.litura,and blue is B.mori.

圖4 草地貪夜蛾、斜紋夜蛾和家蠶中GST氨基酸的突變位點分析Fig.4 Amino acid replacements of GST in Spodoptera frugiperda,Spodoptera litura and Bombyx mori注：(A) GST蛋白質序列對齊。發生錯義突變位點處用紅框標識，數字代表突變氨基酸位置。(B) 基于PolyPhen-2軟件預測第107位氨基酸殘基處的氨基酸替換引起蛋白質功能變化的可能性。家蠶中該位置的酪氨酸(Y)替換為斜紋夜蛾和草地貪夜蛾中的組氨酸(H)。PROBABLY DAMAGING，最高級別可能性的影響。Note:(A) Alignment of Protein sequence of GST.(B) Possibility of the amino acid replacement at residue 107 to affect protein function predicted by the PolyPhen-2 algorithm.Yyrosine (Y) in B.mori replaced by histidine (H) in S.litura and S.frugiperda.POSSIBLY DAMAGING,the highest degree of possibility to affect protein function.

表3 草地貪夜蛾、斜紋夜蛾、家蠶 GST 基因錯義替換位點統計Table 3 Non synonymous replacements of GST in Spodoptera frugiperda,Spodoptera litura and Bombyx mori

2.1.3ABC轉運蛋白鑒定與分析

對草地貪夜蛾、斜紋夜蛾和家蠶ABC轉運蛋白家族進行注釋，分別鑒定出102個、99個以及64個ABC基因，根據ATP結合位點的序列相似性，昆蟲的ABC轉運蛋白被分為8個亞家族(A-H)，以亞家族C含量最為豐富，ABCH和ABCG轉運蛋白的結構組織相似，亞家族H未被注釋出來，有趣的是，斜紋夜蛾未被注釋出的40個蛋白有14個歸類于ABC轉運蛋白亞家族B，另外有17個歸類于ABC轉運蛋白亞家族E，且都發生了明顯的基因擴張現象(圖5)。

圖5 草地貪夜蛾、斜紋夜蛾及家蠶ABC的貝葉斯法系統發育樹Fig.5 Bayesian phylogenetic tree of ABC in Spodoptera frugiperda,Spodoptera litura and Bombyx mori 注：系統發育樹分枝顏色的深淺代表分值的高低，三角形代表基因顯著擴張部分，外層標簽顏色代表物種，紅色為草地貪夜蛾，綠色為斜紋夜蛾，藍色為家蠶。Note:The shade of the branch color of the phylogenetic tree represents the score,the triangle represents the significantly amplified part of the gene,and the outer label color represents the species.Red,S.frugiperda,green,S.litura,and blue,B.mori.

3 結論與討論

草地貪夜蛾食性雜，寄主范圍廣，與近緣物種斜紋夜蛾相比，更偏愛禾本科植物如：高粱、小麥、水稻、煙草等，而昆蟲的解毒代謝能力與寄主范圍以及偏食性有很大的關系 (Ramseyetal.,2010)，初步的分析發現，草地貪夜蛾解毒代謝相關基因數目遠遠大于斜紋夜蛾和家蠶，說明解毒代謝酶的擴張有利于草地貪夜蛾更好的降解不同寄主植物的次生性代謝產物。

細胞色素P450涉及許多昆蟲生理功能，包括對信號分子的代謝、宿主植物的適應性及殺蟲劑的抗性等，其中最為重要的功能是參與農藥、毒素、污染物等解毒的過程(Scottetal.,1998;郭亭亭等,2009)，而在草地貪夜蛾的細胞色素P450中，CYP3簇與CYP4簇的基因數目顯著擴張，CYP3簇涉及的基因主要參與農藥等外源性物質的代謝(Feyereisenetal.,2012)，CYP4簇涉及的基因主要的功能則是代謝外源有毒化學物質、參與脂肪酸羥基化、生物合成和代謝等(Feyereisenetal.,2006)。CYP3、CYP4簇中基因數量的顯著增多，暗示著草地貪夜蛾的相關解毒能力更為強大，解毒代謝機制更為復雜，能夠及時將外界有毒物質進行氧化，使脂溶性物質轉變成水溶性物質而被排除體外，更快速高效地降解外源有毒物質。更為有趣的是，我們選取P450 基因中的一顯著擴張分支進行序列分析，通過統計發現，在草地貪夜蛾、斜紋夜蛾、家蠶相對保守的氨基酸序列中，草地貪夜蛾共7處位點發生錯義突變，經預測這些突變極有可能影響蛋白質的功能。對于每一處位點，錯義突變在夜蛾中出現的數量與頻率均明顯高于家蠶，暗示該突變可能與夜蛾科昆蟲的解毒能力有關，而同為夜蛾科的草地貪夜蛾與斜紋夜蛾相比較下，草地貪夜蛾的錯義突變位點的拷貝又顯著高于斜紋夜蛾，推測草地貪夜蛾通過保留錯義突變的解毒酶拷貝并選擇將其進行大量擴張，使突變后的解毒酶的相關功能得以加強。

谷胱甘肽轉移酶，作為昆蟲解毒酶系主要成員之一，主要催化谷胱甘肽和有毒物質扼合而生產毒性較低的扼合物(Sandermannetal.,2012)。GST基因的數量增加與擴張，增強了草地貪夜蛾對植物次生有毒代謝物、農藥等的解毒能力，進而導致其在短期內對多種化學農藥及Bt產生抗性。對草地貪夜蛾GST基因的聚集擴張分支進行統計，并與斜紋夜蛾、家蠶進行比較，發現了5處草地貪夜蛾特有的錯義突變，這些突變在斜紋夜蛾、家蠶中僅有一個突變，推測這可能與草地貪夜蛾一些獨特的解毒能力有關。

細胞色素P450和谷胱甘肽轉移酶除了作為昆蟲解毒酶系的主要成員，也是昆蟲氣味降解酶主要成員之一，草地貪夜蛾能夠識別并定位種類繁多的寄主、更為頻繁地交配與產卵，與其嗅覺、味覺受體的擴張相關(黃鈞鴻等，2019)，但同時草地貪夜蛾也必須具備更強大的氣味降解能力，使產生神經沖動后殘余的氣味分子迅速降解失活，從而保證了昆蟲嗅覺系統的高敏感性。因此細胞色素P450和谷胱甘肽轉移酶的擴張，可能增加了草地貪夜蛾能夠識別的氣味分子種類及識別的敏感性，使其大規模遷移與入侵能力在一定程度上優于斜紋夜蛾。

此外，已有研究表明節肢動物的ABC轉運蛋白和藥物抗性相關(Labbéetal.,2011b)，在煙芽夜蛾Heliothisvirescens中發現ABCC2的突變有利于增強Bt毒素抗性(Gahanetal.,2010;Baxteretal.,2011;Atsumietal.,2012)。相對于家蠶，在草地貪夜蛾中ABCC基因家族數量的增加，推測它可能對轉基因Bt玉米的抗性與快速適應相關。同時發現，ABCE基因在斜紋夜蛾中也出現了擴張的現象，然而大多數真核生物中只有一個ABCE基因，它在所有生物的進化具有高度的保守性且并沒有轉運的功能，出現擴張具體的原因有待未來進一步探討。

總之，草地貪夜蛾解毒代謝相關基因數量的擴張、尤其是某些分支中具有錯義突變的蛋白質的基因數量增多，有利于其處理種類更廣泛的外源有毒物質、氣味物質，并更快速地降解，使其具備更強的解毒能力和氣味敏感性，成為其能夠在缺乏天敵的情況下快速入侵的重要原因之一，未來可通過進一步對解毒代謝相關蛋白的研究，研發出更具特異性的農藥產品，有利于開展對草地貪夜蛾更好的防控措施。