二氧化碳聯合核桃殼提取液促進單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3的生長和油脂積累

邢海亮，董訓贊，3，韓本勇，耿樹香，寧德魯，馬婷，余旭亞

（1昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明650500；2云南省林業與草原科學院，云南昆明650051；3云南貴澳農業科技集團，云南昆明650100）

近年來，由于微藻具有光合效率高、生長周期短、油脂含量高等優勢，被公認為制備生物柴油的新型生物質能源[1-2]。然而，較高的生產成本及較低的生物量產率和油脂產率限制了利用微藻制備生物柴油的工業化發展[3-4]。利用廢棄物中的營養物質培養微藻，可以有效地降低微藻生產成本，同時廢棄物得到資源化利用，成為研究熱點[5]。

核桃是營養豐富的堅果，種植廣泛，核桃殼作為核桃產品加工過程中的副產物，可以用于色素的提取、制作活性炭和拋光材料等[6-7]。然而大部分核桃殼卻被就地焚燒，不僅造成了資源的浪費，還會帶來嚴重的環境污染。研究指出，核桃殼中含有多種微量元素及豐富的多酚物質[8]。多酚作為一種抗氧化劑，具有較強的抗氧化性[9]。Zhao 等[10]研究指出，抗氧化劑可以通過調節與油脂合成相關的酶的活性，進而有效促進非生物脅迫下微藻中油脂的積累。此外，在微藻的培養過程中，通入適當濃度的CO2，有利于提高微藻的光合作用效率，促進微藻生物量的積累[11]。有研究指出，在BG-11無碳培養基中，當外源通入5% 的CO2時，小球藻FACHB-1580和柵藻FACHB-1618最大生物量達到3.5g/L 和5.4g/L，分別是對照組的1.41 倍和1.46倍[12]。然而，核桃殼提取液（walnut shell extracts，WSE）聯合CO2用于微藻培養的研究鮮有報道，研究CO2對WSE中微藻生長和油脂積累的影響，有利于了解CO2作用下WSE中微藻生長和油脂合成的相關機制。

本文以單針藻Monoraphidium sp. QLZ-3 為對象，以WSE為培養基，研究了外源通入CO2的條件下，微藻生物量產率和油脂產率的變化及對WSE 中多酚的吸收。同時對微藻細胞內核酮糖1,5-二磷酸羧化酶基因（ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，rbcL）相對表達水平和與油脂合成相關酶的活性進行了檢測。將微藻培養與核桃殼的利用相結合，為提高微藻的生物量產率和油脂產率，降低微藻培養成本，以及核桃殼的環境友好的資源化利用提供一定的指導依據。

1 材料與方法

1.1 原料與培養基的制備

以單針藻Monoraphidium sp. QLZ-3 為研究對象（本實驗室篩選、保存）[13]。稱取適量的核桃殼（云南省林業科學院提供）與10倍質量的蒸餾水混合，在95℃條件下提取4h，得到褐色的WSE，經8層紗布過濾后，添加NaNO3（1.16g/L），調整pH至6.8～7.0，分裝至生物反應器（?0.06m×h0.51m）中，121℃滅菌20min。將單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3接入上述培養基中（初始接種量為0.4g/L），分別通入不同濃度CO2（空氣、4%、8%、12%和16%），氣體流速為0.5L/min，光照強度6500lux，培養溫度25℃±1℃，每組設置3個平行。

1.2 儀器與設備

FA2004N 分析天平，LDZX-50KBS 滅菌鍋，VS-840-1超凈工作臺，Ultrospec 2100pro紫外可見分光光度計，RF-540 熒光分光光度計（Shimadzu），5804R 高速低溫離心機（德國Eppendorf 公司），1730R 高速冷凍離心機（丹麥Labogene Scanspeed公司），FD5-12冷凍干燥機（西盟國際集團），Agilent 7890A系列氣相色譜儀（Agilent Technologies）。

1.3 生物量、油脂含量的測定[14]

（1）生物量 每天取10mL（V）藻液，3500r/min 離心10min，去上清液，冷凍干燥后，稱取藻粉質量（w1）。微藻生物量Y（g/L）的計算如式(1)。

Y = w1/V (1)

（2）油脂含量 將新鮮的藻液冷凍干燥后，稱取0.3～0.5g（m1）干藻粉與2 倍質量的石英砂混合，充分研磨40min，用3mL 氯仿甲醇溶液（2∶1，體積比）提取油脂，于25℃、150r/min 條件下振蕩提取30min后，離心（5000r/min，10min），收集上清液。重復上述提取操作3 次，合并上清液，置于預先干燥稱重的離心管（w2）中，40℃干燥至恒重（w3），油脂含量η（%）計算如式(2)。

1.4 CO2固定效率及氣液傳質系數的測定

二氧化碳固定效率依據式（3）計算[15]。

式中，FCO2為CO2固定效率，mg·L-1·d-1；Pb為生物量產率，mg·L-1·d-1；a 為單位生物量固定CO2的質量。

氣液傳質系數[16]測定方法為：先將光生物反應器中不含微藻的培養基以99.99%的氮氣曝氣1.5h后，再以不同濃度的CO2曝氣，培養基溫度為25±1℃，測量60min 內培養基中溶解CO2濃度的變化，每5min記錄1次，通過氣液傳質方程和亨利定律計算傳質系數KLa。計算過程如式(4)。

1.5 rbcL基因表達分析

使用Primer5.0 設計引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成18S和rbcL酶基因的上下游擴增引物（表1），并以此進行熒光定量PCR。

表1 酶基因熒光定量引物

Trizol 法提取不同濃度CO2處理下單針藻Monoraphidium sp. QLZ-3 內的RNA，利用逆轉錄試劑盒（TaKaRa）將RNA 逆轉錄合成cDNA，以其為模板進行RT-PCR 擴增，檢測不同濃度CO2處理下單針藻rbcL 基因表達的變化。通過ABI 7500熒光定量儀對rbcL 基因的表達進行定量，RT-PCR的數據結果用2-ΔΔCT（Livak）的方法處理分析。以18s基因作為內標以調節RNA的用量和循環數，使內標基因在誘導條件下的表達豐度一致，最終得到基因表達量之間的倍數關系。

1.6 多酚含量測定[17]

WSE 中總多酚含量采用Folin-Ciocalteu 法測定：稱取干燥至恒重的沒食子酸10.0mg，加入到蒸餾水中定容至100mL。分別取0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL 和0.9mL 沒食子酸溶液于10mL 的比色管中，加入Folin-Ciocalteu 試劑0.5mL，1min 后加入碳酸鈉溶液1.5mL（200g/L），用蒸餾水定容至刻度線處，混勻，40℃保溫2h 后，迅速冷卻。在760nm 處測定吸光度，建立標準曲線。按照上述方法測定樣品中多酚的含量。

1.7 酶活性測定[18]

單針藻Monoraphidium sp. QLZ-3 中蘋果酸酶（malic enzyme，ME）、乙酰輔酶A 羧化酶（acetyl coenzyme A carboxylase，ACCase）和磷酸烯醇式丙酮 酸 羧 化 酶 （phosphoenolpyruvatecarboxylase，PEPC）的活性使用比色定量試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）測定。

1.8 脂肪酸組成分析

將2mL 3%的硫酸-甲醇（體積比）溶液加入到烘干的油脂中，70℃回流2h 后，加入2mL 正己烷震蕩提取4h，取正己烷相進行氣相色譜-質譜（GC-MS）分析[19]。

1.9 統計分析

本文全部實驗均設置3 組平行,利用ANOVA(SPSS19.0)一步法分析實驗數據，P＜0.05表示差異顯著，后文中用“*”表示；P＜0.01表示差異極顯著，后文中用“**”表示。

2 實驗結果與討論

2.1 CO2對WSE中單針藻生物量的影響

不 同 濃 度 的 CO2對 WSE 中 單 針 藻Monoraphidium sp. QLZ-3 生長的影響如圖1 所示。在培養過程中，隨著CO2濃度的不斷提高，微藻的生物量逐漸增加，當CO2濃度達到12%時，微藻的生物量達到最高，為1.18g/L，是對照組的1.33倍。繼續增加CO2的濃度，微藻的生物量出現下降趨勢。近期研究指出，向糖蜜酒精廢醪液中添加褪黑素，單針藻Monoraphidium sp. QLY-1 的生物量達到1.22g/L[1]，相比對照組提高了41.82%；在80mg/L黃腐酸的作用下，微藻的生物量提高了52.26%[9]。諸多研究表明，在微藻的生長過程中，通入適當濃度的CO2，可以促進微藻光合作用的進行，使得藻細胞快速生長[11,20]。有研究指出，當向生活污水中通入2.5%的CO2時，柵藻的生物量達到1.37g/L，是對照組的1.54 倍[21]。適宜濃度的CO2有助于微藻的生長，但當CO2的濃度超過一定的范圍時，微藻的生長就會受到抑制[22]。這與本實驗結果一致，將WSE中的CO2濃度增加至16%時，微藻的生長受到抑制（圖1）。這是由于持續通入高濃度的CO2會迅速降低溶液pH，可能抑制相關酶活性，從而使微藻的生物量降低[12]。

圖1 不同濃度CO2對WSE中單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3生物量的影響

2.2 CO2 對WSE 中單針藻油脂及生物量產率的影響

如圖2 所示，當WSE 中CO2的濃度為12%時，單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3 的油脂含量最高，為49.54%，是對照組的1.18 倍。此時，生物量產率和油脂產率為196.85mg/(L·d)和97.52mg/(L·d)，分別是對照組的1.33 倍和1.57 倍。相關研究指出，利用養豬廠廢水培養微藻，油脂含量最高可達28.8%，相比對照組提高了53.76%[23]；利用水產養殖廢水培養柵藻LX1，其油脂含量可達到31.6%[24]。相關研究表明，由于微藻中誘導轉運機制的存在，適當濃度的CO2可以促進微藻的生長和積累脂類[25]。當BG-11 培養基中通入5% 的CO2時，柵藻Scenedesmus sp. FACHB-1600 的油脂產率達到104.163mg/(L·d)，相比對照組提高了51.15%[22]。本實驗結果表明，適宜濃度的CO2有助于WSE中單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3的生長油脂積累，提高生物量產率和油脂產率。

圖2 不同濃度CO2對微藻油脂含量、生物量產率和油脂產率的影響

此外，WSE的制備成本為CNY25.05/t（天然氣價格為CNY2.4/m3，水價格為CNY3.45/t），在12%的CO2作用下，微藻生物量和油脂的原料成本分別為CNY21.23/kg 和CNY42.85/kg。研究指出，利用傳統培養基BG-11 培養柵藻Scenedesmus SDEC-13時，微藻生物量和油脂培養的原料成本則分別為CNY144.00/kg和CNY709.01/kg[26]。結果表明，WSE聯合CO2用于微藻的培養可以降低微藻生物柴油制備的原料成本。

2.3 CO2固定效率及傳質效率

不同濃度的CO2對WSE 中傳質系數（KLa）及微藻對CO2的固定效率的影響如圖3 所示。在微藻的培養過程中，隨著CO2濃度的增加，KLa值逐漸增加。當CO2的濃度為12%時，KLa值為0.073min-1，此時CO2的固定效率最高，達到0.36g CO2/(L·d)。結果表明，當CO2的固定效率最高時，單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3的生物量產率及油脂產率達到最大（圖2）。而當CO2的濃度為16%時，雖然KLa值增加至0.081min-1，但CO2的固定效率下降至0.36g CO2/(L·d)（圖3），微藻的生物量產率和油脂產率也分別下降至174.05mg/(L·d)和74.97mg/(L·d)（圖2），這可能是由于較高的CO2濃度限制了微藻的生長[27]。本實驗結果顯示，當KLa值為0.073min-1時，WSE 中有足夠的持續的CO2供給微藻的生長，而當KLa值增加0.081min-1時，由于CO2濃度過高而降低了其固定效率，從而使微藻的生長（圖1）和油脂積累（圖2）降低。

圖3 不同濃度CO2在WSE中對CO2的固定（柱形圖）及傳質效率（折線圖）的影響

2.4 WSE中多酚含量變化

圖4 不同濃度CO2下WSE中多酚含量變化

多酚具有很強的抗氧化特性，可以減緩細胞的氧化損傷[9]。Zhao 等[10]研究指出，抗氧化劑可以通過調節油脂合成相關途徑，進而促進微藻中油脂的積累。由圖4可知，在微藻的培養過程中，WSE中的多酚含量逐漸降低。Lu等[28]指出，多酚是一種微量營養元素，可被細胞吸收利用。在CO2的濃度為12%的條件下，WSE 中的多酚含量從65.87mg/L 下降至41.09mg/L，相比對照組降低了16.00%。圖1表明，12%的CO2促進了微藻的生長，WSE中更多的多酚被單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3吸收（圖4），從而促進了微藻中油脂含量的積累（圖2）。Paz-Yépez 等[17]研究指出，多酚可以阻礙自由基與脂質分子的結合，從而減少由于脂質氧化引起的細胞損傷，促進油脂的積累。褪黑素作為一種抗氧化劑（melatonin，MT），1μmol/L 的MT作用下，單針藻Monoraphidium sp. QLY-1 的油脂含量達到49.6%，是同等條件下對照組的1.32倍[29]。Che等[18]研究表明，抗氧化劑促進微藻的生長和油脂的積累，與油脂合成相關酶的活性及酶基因的表達有關。

2.5 CO2 對單針藻中與油脂合成相關酶活性的影響

ACCase 是一種依賴生物素的變構羧化酶，主要催化依賴ATP 的乙酰輔酶A（acetyl coenzyme A）轉化為丙二酰輔酶A，是脂肪酸合成過程中的限速酶[1,28]。在CO2的作用下，單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3 中，ACCase 的活性變化如圖5 所示，隨著CO2濃度的增加，藻細胞內ACCase 的活性逐漸增強，當CO2濃度的增加至12%時，ACCase 的活性最大，達到對照組的1.23～1.38 倍。繼續增加CO2的濃度，ACCase的活性開始下降。前人研究指出，由ACCase 催化生成的丙二酰輔酶A 可以有效抑制脂肪酸的氧化[30]。通過上調ACCase 的活性，可以促進衣藻Chlamydomonas reinhardtii 油脂含量的提高[1]。本實驗研究結果顯示，向WSE中通入適宜濃度的CO2，可以提高單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3中ACCase的活性，促進油脂的積累。

圖5 不同濃度CO2對微藻中ACCase活性的影響

蘋果酸在ME 的作用下降解為丙酮酸，還原NADP+，為脂肪酸的合成提供足夠的NADPH[1]。如圖6所示，CO2促進了微藻中ME活性的提高。培養第2 天時，ME 活性的提高最大，是對照組的2.60倍。在脂肪酸合成的過程中，脂肪酸合成酶可利用由ME 還 原 得 到 的NADPH[31]。 在 單 針 藻Monoraphidium sp. QLZ-3 的培養過程中，ME 的活性始終高于對照組（圖6），這就為微藻油脂的合成提供了足夠的NADPH，促進了微藻油脂的積累（圖2）。Xue 等[32]研究指出，通過提高ME 的活性，三角褐指藻的油脂含量提高了2倍。這與本實驗結果一致，CO2促進了微藻中ME 的活性，進而促進了微藻油脂含量的提高。

圖6 CO2作用下微藻中ME活性的變化

圖7 不同濃度CO2對單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3中PEPC活性的影響

PEPC 是光合作用C4途徑中的關鍵酶之一，催化磷酸烯醇式丙酮酸的β-C羧基化并生成草酰乙酸和無機磷酸，它與ACCase 之間存在著底物的競爭[33-34]。在微藻培養過程中，實驗組和對照組中PEPC 的活性均出現先降低后增加的趨勢，但實驗組中的PEPC活性始終低于對照組（圖7）。培養前期，ACCase和ME的活性較高（圖5和圖6），油脂合成較快，PEPC的活性逐漸下降（圖7），培養后期，ACCase和ME的活性較低（圖5和圖6），油脂緩慢合成，PEPC活性開始逐漸增高。Ghosh等[25]研究指出，通過上調衣藻Chlamydomonas reinhardtii中PEPC的活性，其油脂含量下降了37%。而PEPC基因的敲除，促進了三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum中油脂的積累[35]。本實驗結果表明，CO2可以降低單針藻Monoraphidium sp. QLZ-3 中PEPC的活性，促進微藻油脂的積累。

2.6 CO2對WSE中單針藻rbcL基因表達量的影響

單針藻Monoraphidium sp. QLZ-3 中rbcL 基因相對表達量的變化見圖8。在CO2的作用下，微藻細胞內rbcL 基因的相對表達量均有不同程度的增加。與對照組相比，當CO2的濃度為12%時，在培養的1～3 天，rbcL 基因的相對表達量從1.64倍增加至2.63倍，隨后開始下降，到第6天時下降至1.49 倍。Ikaran 等[36]研究表明，rbcL 基因與CO2的固定有關，其表達量的上調可以加快光合作用固碳。圖8 表明，12%的CO2作用下微藻中rbcL 基因表達量上調，促進了微藻對CO2的吸收，為微藻的生長提供更多的碳骨架，從而促進了微藻的生長（圖1）和CO2的固定（圖3）。Che 等[18]研究表明，微藻固定的CO2用于合成糖、脂質等生物大分子。缺氮條件可以促進小球藻chlorella vulgaris var L3中rbcL 基因表達量的上調，油脂含量增加了25%[36]。本實驗結果顯示，12%的CO2上調了rbcL基因表達量，促進了CO2的固定、微藻的生長及油脂的積累。

圖8 不同濃度CO2對單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3的rbcL基因相對表達量影響

2.7 WSE中單針藻脂肪酸的組成分析

單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3脂肪酸的組成如表2 所示，C16∶0（16 表示脂肪酸碳鏈的長度，0表示碳鏈上不飽和鍵的個數）、C18∶1、C18∶2和C18∶3是微藻脂肪酸的主要成分。與對照組相比，12%的CO2作用下，微藻中的C16∶0 含量增加了36.27%，而C18∶2的含量則減少了34.15%，C18∶1和C18∶3 的含量基本保持不變，這就導致了實驗組中飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFAs）含量上升，多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）含量下降，單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）含量保持不變。12%的CO2作用下的實驗組中不飽和度（degree of unsaturation，DU）為103.83，相比對照組下降了15.48%，可作為生產生物柴油的原料[37]。此外，WSE中所培養微藻脂肪酸的長鏈飽和因子（long chain saturation factor，LCSF）和冷濾點（cold filter plugging point，CFPP）如表2 所示。LCSF 是用來計算生物柴油的CFPP值的，CFPP值越低，生物柴油的低溫流動性能越好。由于各國所處的環境不同，對CFPP 值也有不同的規定，而歐洲柴油標準并未對生物柴油的CFPP 值提出具體的要求，但我國（GB/T25199—2010）規定其值不高于-5～12℃。本實驗結果表明，以WSE 為培養基，培養微藻得到的脂肪酸符合生產生物柴油的標準。

3 結論

本文研究了不同濃度的CO2對WSE 中單針藻Monoraphidium sp. QLZ-3 生長和油脂積累的影響。12%的CO2上調了rbcL 基因的表達量，加快了CO2的固定效率和多酚的吸收，同時上調了ACCase 和ME 的活性，下調了PEPC 的活性，提高了單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3的生物量產率和油脂產率。綜上，CO2聯合WSE培養微藻，為微藻的工業化培養和核桃殼的綜合利用提供了新的思路。

表2 不同CO2濃度對WSE中單針藻Monoraphidium sp.QLZ-3脂肪酸的組成的影響