納米羥基磷灰石增強聚己內酯/明膠纖維膜的制備及其性能

任欣，金蜀鄂，李玉寶，李吉東

（四川大學納米生物材料研究中心，四川成都610064）

牙周炎是一種可導致牙周組織破壞并最終導致牙齒脫落的多發性炎癥性疾病，而牙周組織的功能性修復是臨床面臨的一大難題[1-2]。在治療牙周病的方法中，由Nyman 等[3-7]提出的引導組織再生術（guided tissue regeneration，GTR）是目前臨床上常用的治療方法，起保護血凝塊、維持牙周組織再生空間的作用，同時防止纖維結締組織競爭性長入的GTR膜在這項技術中發揮著關鍵作用[8-9]。

目前臨床上商品化的GTR 膜包括以膨體聚四氟乙烯（e-PTFE）為代表的不可生物降解膜和以膠原膜為代表的可降解膜[10-11]。雖然不可降解膜具有化學性質穩定、較好的機械強度等優點，但需二次手術取出，因此其應用受到限制[12]。而膠原膜雖能避免二次手術，但是存在降解速度不可控、力學強度低等缺點，可能會引發一些倫理和文化問題[13-14]。因此，研制新型高性能GTR膜仍是生物材料領域的熱點之一。

目前，制備GTR 膜的技術包括自組裝、相分離、靜電紡絲等[15-16]。靜電紡絲法因制備的引導組織再生膜具有類細胞外基質結構，這種結構有利于細胞的黏附、遷移、增殖和分化，近年來備受關注。且通過靜電紡絲法可以調控膜中纖維的直徑、成份、纖維取向以及孔隙率等，實現膜性能調控[17-18]。近年來，包括聚己內酯（PCL）、聚乳酸（PLA）、聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）、明膠（Gel）、膠原（Col）和殼聚糖（CS）等聚合物材料均被用來制備GTR 膜[19-23]。其中PCL 因具有可降解、無毒、生物相容性好等特性而備受關注，但純的PCL纖維膜由于其較強的疏水性而不利于細胞的黏附[24-25]。有研究表明PCL 中加入明膠能夠提高細胞活性，促進細胞的黏附、增殖和分化[26-28]。此外，納米羥基磷灰石（n-HA）作為骨組織中重要組成成分，加入纖維中能提高GTR 膜的生物相容性、生物活性、骨傳導性等[29-31]。Rajzer 等[32]通過靜電紡絲法將n-HA 混入PLDL 中以制備GTR 膜，并對膜的生物學性能進行了表征，結果表明n-HA的加入能提高細胞黏附性、促進細胞的增殖和分化。

因此，本文采用靜電紡絲法制備納米羥基磷灰石增強的聚己內酯/明膠/納米羥基磷灰石復合纖維膜，研究n-HA添加量對復合纖維膜力學性能、降解性能的影響，旨在研制出一種既具有良好力學性能，又具有適當降解性能的復合纖維結構引導組織再生膜。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

PCL（分子量80000g/mol）購自深圳光華偉業股份有限公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）和三氟乙醇（TFE）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；乙酸（分析純）購自成都金山化學試劑公司；明膠、無水乙醇購自成都科龍化工試劑廠。根據文獻所述方法實驗室自制n-HA[33-34]。

1.2 主要儀器

掃描電鏡（SEM，JSM-6500LV，JEOL）；X射線衍射儀（XRD，DX-2500，丹東方圓）；熱重分析儀（TG，TGA/DSC-2,Mettler Toledo）；紅外光譜儀（FTIR，Nicolet 6700，美國熱電）；電子萬能試驗機（AG-IC50，日本島津）；靜電紡絲機（Ucalery，北京永康樂業）；透射電鏡（TEM，Tecnai G2 F20 S-TWIN，美國FEI公司）等。

1.3 靜電紡絲法制備納米纖維膜

將n-HA 加入裝有適量四氟乙烯（TFE）溶劑的錐形瓶中，超聲分散1h。然后在不斷攪拌下將PCL（質量）和Gel（體積）比例為13%溶于錐形瓶中。待PCL/Gel 完全溶解后加入體積分數為3%的乙酸混合均勻，得到共混紡絲液，備用。按mPCL/Gel∶mn-HA分別為100∶0、100∶5、100∶10、100∶15（其中mPCL∶mGel=7∶3），即可得到四種紡絲溶液，記為P7G3、P7G3/n-HA-5、P7G3/n-HA-10、P7G3/n-HA-15。

在紡絲電壓為-2kV/6kV、接收板距離為15cm、推注速度為0.45mL/h 的參數下進行紡絲即可制得不同n-HA 含量的纖維膜，將制得的膜在50/50（mmol/L）的EDC/NHS 乙醇交聯液中交聯24h，然后用無水乙醇洗除膜上殘留的交聯劑，真空干燥，備用。

1.4 納米纖維膜理化性能表征

形貌表征：取下收集在鋁箔上的纖維膜，噴金，然后在20kV 加速電壓下用SEM 觀察其形貌。根據SEM 照片，采用Image J 分析軟件，隨機測量纖維直徑（d≥100），計算纖維平均直徑及直徑分布范圍。采用TEM觀察纖維中n-HA的分布。

TG：在氧氣氛圍中，通過熱重分析表征纖維膜的熱學特性以及n-HA在膜中的實際含量。測試溫度范圍為30～550℃，升溫速率為10℃/min。

XRD 分析：采用X 射線衍射分析儀對纖維膜進行物相分析，測試條件：銅靶（λ=0.15418nm），管電壓為40kV，管電流為25mA，掃描速度為0.03°/min，掃描范圍為5°～80°。

FTIR 分析：采用紅外光譜儀對交聯后的纖維膜進行紅外光譜分析（4000～650cm-1）。

力學性能表征：將交聯后的纖維膜制成10mm×50mm 的樣條，運用電子萬能試驗機測量膜的抗拉強度和斷裂伸長率，拉伸速度為10mm/min，每組5個平行樣。

1.5 降解實驗

將纖維膜剪成10mm×10mm的矩形，稱取質量后裝入5mL離心管中，加入3mL PBS溶液。然后將離心管置于搖床中，于37℃，150r/min條件下進行體外降解實驗。每2天更換一次PBS溶液。最后將纖維膜在設定的時間點取出，蒸餾水清洗，干燥后稱重。每組材料設置5個平行樣。

2 結果與討論

2.1 纖維膜形貌

圖1 不同n-HA含量纖維膜交聯前的掃描電鏡圖、纖維直徑分布圖和透射電鏡圖

圖2 不同n-HA含量纖維膜交聯后掃描電鏡圖和纖維直徑分布圖

由圖1可知，各纖維膜的纖維形態良好、無串珠纖維形成，纖維直徑主要分布在200～400nm，纖維平均直徑隨n-HA含量的增加而降低。這是因為在PCL/Gel 溶液中添加n-HA 可增加溶液的導電性，從而使得帶電射流在電場中所受的拉伸力增加，纖維直徑降低[35]。此外，隨著n-HA 含量的增加，在纖維膜表面逐漸有n-HA顆粒的聚集，且纖維局部出現凸起，TEM 結果表明纖維中凸起部分為n-HA含量較高的地方；另外，從TEM結果可以看出n-HA含量為5%和10%時，n-HA較均勻地分散在纖維中，當n-HA 含量為15%時，n-HA 分散不均勻且會出現團聚并凸起于纖維表面。圖2為纖維膜交聯后照片，從圖中可以看到，交聯后膜仍保持較好的纖維結構，但纖維發生溶脹，使得纖維直徑增加。當纖維與交聯溶液接觸時，溶劑分子沿著纖維的微隙進入到無定形區，削弱了纖維大分子間的作用力，使分子間的距離加大，空隙增大，纖維發生溶脹，纖維直徑增加[36]。

2.2 紅外光譜

圖3 不同n-HA含量的纖維膜紅外譜圖

2.3 XRD

圖4 n-HA和不同n-HA含量纖維膜的XRD譜圖

復合材料的結晶性能影響材料的其他理化及力學性能，因此，通過XRD 分析所制備的復合纖維膜的結晶狀態。從圖4 可以看出，n-HA 在2θ=25.9°和2θ=31.9°處存在明顯的特征峰，P7G3 膜在2θ=21.6°和24.0°處出現PCL特征衍射峰。由圖4可知，n-HA 加入后纖維膜中PCL 的特征衍射峰未發生明顯變化，這說明n-HA的加入對PCL的結晶狀態影響較小，主要是因為n-HA 與PCL/Gel 之間沒有化學反應，只存在較弱氫鍵作用，這些作用力未影響到材料分子鏈的排列，因此，n-HA 的加入未改變PCL 的結晶結構[41]。此外，從圖4 可以看出，隨著n-HA 含量的增加，n-HA 的特征衍射峰逐漸增強。當n-HA含量為5%時，基本觀察不到n-HA的特征衍射峰；當n-HA 含量為10%時，有n-HA特征衍射峰出現，但峰強度較低；當n-HA含量為15%時，能明顯觀察到n-HA特征衍射峰，其峰強度也增加。主要是因為n-HA含量較低時，低含量的n-HA 被包裹在纖維內部，從而沒有顯現出n-HA 的特征衍射峰；而隨著n-HA 增加，分散在纖維表層的n-HA 增多，因此n-HA 的特征衍射峰逐漸出現，且峰強度隨著n-HA 含量增加而逐漸增強。

2.4 熱重

圖5 纖維膜的熱重曲線

圖5是P7G3、P7G3/n-HA-5、P7G3/n-HA-10、P7G3/n-HA-15 纖維膜的熱重曲線。從圖中可以看出，P7G3 膜的起始分解溫度為182℃，加入n-HA后，復合膜的起始分解溫度升高，不同n-HA含量的纖維膜具有相近的起始分解溫度（250℃）和最大分解溫度（368℃），說明n-HA 的加入顯著改善了PCL/Gel纖維膜的熱穩定性，但在本文報道的n-HA 含量范圍內，n-HA 的添加量對纖維膜的熱穩定性無明顯影響。n-HA 加入提高膜的熱穩定性主要是由于納米級的n-HA具有很高的比表面積和較強的表面鍵合能力，在n-HA的作用下材料結構變得緊密，穩定性提高，分子運動需要更多的能量，從而使得添加有n-HA 的纖維膜具有更好的穩定性[42]。此外，從圖中可以看出，P7G3/n-HA-5、P7G3/n-HA-10、P7G3/n-HA-15 纖維膜分解后的殘余量與實驗中n-HA的添加量基本一致。

2.5 力學測試

圖6 纖維膜應力-應變曲線及力學強度統計直方圖

圖6是不同n-HA含量的纖維膜的應力-應變曲線及拉伸強度統計直方圖。圖中可看出，n-HA 加入后纖維膜的拉伸強度和伸長率顯著增加，且隨著n-HA 含量的增加，纖維膜的拉伸強度和伸長率逐漸增加，當n-HA 含量為15%時，相較于P7G3 纖維膜，其拉伸強度和伸長率分別增加203%和240%，達到9.18MPa和180%。其原因可能是n-HA自身粒徑較小，比表面積大，與PCL/Gel 混合后，在物理吸附和氫鍵的作用下與PCL/Gel 產生較強的界面作用，當存在外力作用時，由于n-HA與PCL/Gel 之間的應力場作用使得n-HA 牢固黏附在基體中，且會在纖維中快速產生許多微裂紋，這些微裂紋一方面吸收外應力，另一方面提高基體屈服能力，從而使得纖維材料的拉伸強度和伸長率增加[43]。這一結果與有關文獻報道一致[44-45]。Masoudi等[45]制備了β-TCP 含量為5%、10%和15%的PGS/PCL/β-TCP 纖維膜，力學測試結果表明，隨著β-TCP 含量從5%增加到10%，纖維膜的拉伸強度和楊氏模量也增大，但當β-TCP 含量為15%時，纖維膜的拉伸強度和楊氏模量出現下降，這是β-TCP出現較嚴重的團聚造成的。

GTR 膜需要有良好的力學強度才能滿足臨床手術中的可操作性要求以及在組織再生過程中提供力學支撐。Fu等[31]采用靜電紡絲法制備了PLGA/n-HA 纖維膜，并表征了不同n-HA 添加量下纖維膜的力學性能，結果表明纖維膜的力學強度隨著n-HA 含量的增加出現先增后降的趨勢，當n-HA 添加量為5%時，力學強度達到最大值（3.55±0.55）MPa。Linh 等[28]通過靜電紡絲制備了n-HA 含量為10%、30%和50%的HA-PCL/Gel膜（其中PCL/Gel比例為5∶5），雖然所制備的纖維膜n-HA 含量較高，但纖維直徑（0.12～3.0μm）分布不均，且n-HA 多分布在纖維表面，力學性能測試結果表明纖維膜的拉伸強度隨著n-HA 含量的增加從(1.8±0.1)MPa增大到(3.7±0.2)MPa。而本文制備了n-HA添加量為5%、10%以及15%的n-HA-PCL/Gel 膜，力學性能測試結果表明所制備的纖維膜的拉伸強度均遠遠大于文獻中所報道的拉伸強度。此外，本文中n-HA 最高添加量為15%，這是因為紡絲溶液中PCL 含量較大，當n-HA 含量為20%時，紡絲溶液黏度較高，紡絲變得困難。

2.6 降解實驗

圖7是纖維膜在不同時間點降解后的質量剩余曲線。由圖可知，纖維膜在14 天之前均具有一個快速降解過程，P7G3、P7G3/n-HA-5、P7G3/n-HA-10、P7G3/n-HA-15在第14天剩余質量分數分別為(74.96±1.51)%、(81.25±0.76)%、(88.42±2.92)%、(86.91±0.64)%，隨后降解速度變慢，但與P7G3 纖維膜相比，n-HA 加入后纖維膜的降解速率明顯下降。復合膜的降解主要是有機高分子的降解，n-HA 加入后，復合膜中有機高分子含量相對降低，故降解速率也較慢。

圖7 纖維膜體外降解圖

3 結論

通過靜電紡絲法成功制備了一種n-HA增強增韌的PCL/Gel GTR纖維膜，纖維膜的形貌、力學性能及體外降解性能研究結果表明制備的纖維膜中纖維形態良好，纖維直徑分布于200～400nm，n-HA較均勻分散在纖維中，隨著n-HA含量的增加，纖維膜表面以及纖維內出現n-HA的聚集；交聯后纖維直徑明顯增加。添加n-HA能顯著提高纖維膜的力學性能，隨著n-HA含量的增加，其拉伸強度逐漸增大，當n-HA含量為15%時，其拉伸強度達到9.18MPa、伸長率達到180%。此外，n-HA 的添加降低纖維膜的降解速率。本文制備的n-HA/PCL/Gel纖維膜力學性能較佳，在GTR領域具有較大的應用潛力。