連錢草活性成分的濁點萃取工藝優(yōu)化

周子軒 謝建開 季澤濤 申奧 黃菊

摘? ?要：為優(yōu)化濁點萃取法提取連錢草中活性成分的工藝條件，以提取液對DPPH自由基清除率為指標，采用單因素實驗預先確定各因素的適宜水平，再進一步利用正交實驗確定最優(yōu)工藝條件。實驗結果表明，當料液比為1∶35，平衡時間為60 min，離子濃度為0.7 mol/L，表面活性劑質量濃度為50 g/L時，連錢草活性成分的提取率最大，對DPPH自由基清除率為88.22%。

關鍵詞：濁點萃取;活性成分;連錢草;正交實驗

連錢草屬于唇形科活血丹屬，分布區(qū)域廣泛，在全國各地都很常見。作為中醫(yī)主要藥材，通常用于民間醫(yī)學治療高尿酸血癥、風濕病、痛風、腎炎、腎結石、尿道炎和膀胱炎。從連錢草中提取得到的化學成分主要是黃酮及其苷類、萜類化合物[1]。目前，常用的天然植物提取方法包括水提法、有機溶劑提取以及超臨界萃取等，但各自都存在一定的缺點，如耗時長、污染環(huán)境等，尤其是當今社會對低污染的需求越來越大、重視程度越來越高，因此，選擇一種簡單、高效、環(huán)境友好的提取方法對連錢草的進一步開發(fā)應用具有重要的現(xiàn)實意義[2-3]。

濁點萃取法是近年來出現(xiàn)的一種新興的液-液萃取技術，以中性表面活性劑膠束水溶液的溶解性和濁點現(xiàn)象為基礎，改變實驗參數(shù)引發(fā)相分離，將疏水性物質與親水性物質分離[4-5]。具有操作簡單、提取率高、活性成分在提取過程中不易變性、不使用揮發(fā)性有機溶劑和環(huán)境友好等特點，本實驗選用TritionX-110為表面活性劑進行濁點萃取，通過正交實驗法優(yōu)化提取工藝參數(shù)，考察表面活性劑質量濃度、料液比、離子強度、溫度和平衡時間等對提取效果的影響，從而獲得連錢草活性成分提取的最佳工藝條件。

1? ? 實驗部分

1.1? 實驗儀器和試劑

1.1.1? 儀器

離心機H1850，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;紫外可見分光光度計T6，北京普析通用儀器有限責任公司;超聲波清洗機JP-040S，深圳市潔盟清洗設備有限公司;電子天平JA2003，上海方瑞儀器有限公司;鼓風干燥箱DHG-9070A，蘇州江東精密儀器有限公司。

1.1.2? 試劑

聚乙二醇鋅基苯基醚（TritionX-110），阿拉丁試劑公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），美國Sigma公司;無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉和水楊酸等均為國產分析純。

1.2? 實驗方法

1.2.1 連錢草活性成分提取

連錢草烘干粉碎后過60目篩，稱取1 g粉末樣品，加入TritionX-110水溶液按一定料液比混合均勻，超聲30 min后放入高速離心機（8 000 r/s）中離心30 min，上層液體轉移至錐形瓶，加入適量氯化鈉，置于45 ℃水浴鍋中，出現(xiàn)分層，提取油性部分，加入15 mL無水乙醇，充分震蕩后放入離心機中離心5 min（6 000 r/s），上層液體倒入容量瓶中定容，待測。

1.2.2? DPPH自由基清除率測定

將連錢草活性成分提取液稀釋成最佳樣品質量濃度，用移液槍準確獲得待測樣品液2 mL，吸取濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液6 mL，轉到試管中，充分震蕩，在暗室低溫情況下靜放50 min，無水乙醇作參比液，通過紫外-可見分光光度計在517 nm波長處測定其吸光度值為A1;把2 mL的無水乙醇加入到6 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液中，并測得其吸光度值為A0，把2 mL的無水乙醇加入到6 mL的待測樣品液中，測得其吸光度值為A2。DPPH自由基清除率（S）計算公式為：

S=

1.2.3? 單因素實驗

選取對連錢草活性成分提取率影響較大的4個因素：料液比（表面活性劑溶液體積與連錢草粉末質量之比，mL/g）、離子強度（氯化鈉的濃度，mol/L）、平衡時間（min）、表面活性劑質量濃度（g/L），進行單因素實驗從而確定各因素的適宜水平。

1.2.4? 正交實驗

根據(jù)單因素實驗結果，每個因素選取3個水平進行正交實驗，如表1所示。

2? ? 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1? 平衡時間對DPPH清除率的影響

如圖1所示，當平衡時間增加時，連錢草活性成分提取液的DPPH清除率急劇上升，從40 min開始出現(xiàn)不同程度的下降。因此，選定最優(yōu)平衡時間為40 min。

2.1.2? 料液比對清除率的影響

由圖2可知，當料液比從1∶15到1∶55時，提取液的DPPH清除率先上升而后下降，在1∶35時達到峰值。這是因為隨著液料比增大，提取溶劑越多，活性成分提取率就越大，這就使DPPH清除率提高，所以，濁點萃取的最優(yōu)料液比為1∶35。

2.1.3? 離子濃度對清除率的影響

由圖3可知，當溶液的離子濃度從0.5 mol/L提高到0.6 mol/L時，連錢草活性成分提取液的DPPH清除率上升得非常快，而當離子濃度超過0.6 mol/L時，清除率便開始緩慢下降。這是由于TritionX-110的聚集數(shù)隨著離子強度的增加而增加，TritionX-110對連錢草活性成分的增溶能力得到提高。同時，加入NaCl能改變非離子表面活性劑的濁點溫度。但是，如果NaCl溶液的濃度不斷地提高，溶液濃縮系數(shù)會不斷上升，當達到一定值時，會導致萃取效率變化不明顯，此時，NaCl濃度的影響就不大，同時，考慮到成本的節(jié)約以及回收資源的問題，最終選定NaCl濃度為0.6 mol/L。

2.1.4? 表面活性劑質量濃度對活性成分提取效率的影響

由圖4可知，當表面活性劑質量濃度從20 g/L增加到40 g/L時，提取液的清除率都可達到一個較高的值。當表面活性劑質量濃度從40 g/L升到50 g/L時，對DPPH清除率下降。而當質量濃度超過50 g/L時，又出現(xiàn)上升趨勢，產生這種現(xiàn)象的原因可能是當表面活性劑質量濃度達到一定值時，隨著其質量濃度的增長出現(xiàn)增溶等問題。因此，TritionX-110的最佳質量濃度為30 g/L。

2.2? 正交實驗結果

連錢草活性成分提取液的DPPH清除率正交實驗結果如表2所示。

對正交實驗結果進行極差分析可知，料液比對連錢草活性成分提取物DPPH清除率的影響最大，平衡時間對清除率的影響緊隨其后，影響最小的是離子濃度。因此可得，影響連錢草活性成分提取物DPPH清除率的先后順序為B>A>D>C，即料液比>平衡時間>表面活性劑的質量濃度>離子濃度。分析k值可知，濁點萃取連錢草活性成分的最優(yōu)工藝條件為A3B2C2D3，即平衡時間60 min，料液比1∶35，離子濃度0.7 mol/L，表面活性劑（TritionX-110）的質量濃度50 g/L。

按照最優(yōu)實驗條件，進行3組平行實驗，將提取液稀釋至40 g/L，通過使用紫外-可見分光光度計測量各組的DPPH清除率，分別為84.30%、88.73%和87.64%，其平均值為86.89%，相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為2.66%。可以確定此濁點萃取工藝可行。

3? ? 結語

利用濁點萃取工藝提取連錢草中的活性成分，以對DPPH自由基清除率為考察指標，通過單因素和正交實驗優(yōu)化了連錢草活性成分提取的最優(yōu)條件。

（1）各個因素對提取效率的影響強弱順序是：料液比>平衡時間>表面活性劑質量濃度>離子濃度。連錢草活性成分的最優(yōu)提取工藝是：料液比1∶35，平衡時間60 min，表面活性劑質量濃度50 g/L，離子濃度0.7 mol/L。驗證性實驗得出其清除率平均值為86.89%，相對標準偏差RSD為2.66%，在標準偏差之內。

（2）濁點萃取法用于連錢草活性成分的提取是一種行之有效的方法，黃酮類活性成分可以被表面活性劑有效萃取，實驗以純水為提取劑，不使用有機溶劑等揮發(fā)性物質，成本低、無污染，后續(xù)實驗可進一步表征提取物的化學成分和結構。

[參考文獻]

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[2]姜? ?寧，劉曉鵬，丁峰峻，等.微波輔助提取連錢草總黃酮的研究[J].河南農業(yè)科學，2015，44（4）：169-172.

[3]劉? ?學，曹瑩粲，韓王康，等.濁點萃取法提取黑種草子粕抗氧化劑的工藝研究[J].日用化學工業(yè)，2014，44（11）：624-627.

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