HIF-1α、PD-L1與非小細胞肺癌淋巴轉移的相關性

齊 倩 王春梅 楊 娟 田 英 馮 超

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌中最常見的一類病理類型，其約占肺癌患者總數的85%，且發現時往往處于疾病中晚期，雖然近年來微創手術、放療及免疫靶向治療等手段的開展有效的提升了NSCLC的療效，但此類患者遠期存活率仍顯著較低[1-2]。淋巴結轉移是NSCLC患者病灶擴散的重要方式之一，研究指出，對未發生淋巴結轉移的患者進行預測性評估淋巴結轉移風險對于患者手術及治療具有較好的指導意義[3-4]。Aguiar等[5]研究提出，程序性死亡分子配體(programmed death-ligand 1, PD-L1)是多個免疫細胞表面關鍵免疫檢查點，其表達與NSCLC在治療中發生免疫逃逸具有高度的相關性。上皮-間質轉化作為NSCLC細胞侵襲轉移重要影響因素，乏氧反應在其中扮演了很重要的角色，乏氧反應誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)則是介導乏氧反應的關鍵因素，其表達與NSCLC的侵襲及轉移密切相關[6-8]。但目前國內關于HIF-1α、PD-L1表達水平與NSCLC患者術后淋巴轉移風險的相關研究較少，為此我院對97例患者進行了一項前瞻性研究，報道如下。

資料與方法

一、臨床資料

選擇2015年12月至2017年12月于我院行肺葉切除術且未發生淋巴結轉移的NSCLC患者97例。納入標準：①所有患者均符合《中國原發性肺癌診療規范(2015年版)》中對于NSCLC的診斷標準[9]；②病例資料完整；③于我院行肺葉切除術且術后病理檢查提示無淋巴結轉移和切緣陽性。排除標準：①合并其他類型腫瘤；②嚴重的器官功能障礙；③抗腫瘤治療史；④合并其他肺部疾病。與患者及家屬簽訂知情同意書后納入研究。所有患者年齡范圍45～78歲，平均年齡(56.08±11.27)歲；平均病程(1.34±0.79)個月；TMN分期Ⅰ期44例、Ⅱ期53例；腺癌69例，非腺癌28例。

二、研究方法

1. 病灶組織固定切片： 對術中切除的病灶組織進行甲醛固定后使用石蠟包埋，并按照厚度5 μm進行連續切片備用。

2. 免疫組化染色： 對術中完成的切片進行脫蠟并使用蒸餾水反復沖洗直至切片潔凈，使用山羊血清封閉室溫下30 min對切片進行抗原修復，而后不同樣本分別滴加HIF-1α及PD-L1單抗共同孵育，滴加單抗后樣本于室溫下放置30 min后放入4 ℃環境中保存過夜，次日將樣本取出并于室溫下放置50 min復溫，而后磷酸鹽PBS進行反復沖洗3次，分別滴加HIF-1α及PD-L1二抗，室溫下共同孵育30 min后使用PBS再次進行沖洗3次(5 min/次)，徹底清潔切片周圍液體后滴加顯色劑DAB工作液于室溫下孵育5～10 min后使用蒸餾水沖洗3次，二手使用蘇木素進行復染，隨后對切片進行分化(鹽酸乙醇)及反藍(飽和碳酸鋰)處理，蒸餾水充分沖洗后對切片進行脫水(95%乙醇)、透明處理(二甲苯)，并使用中性樹膠封片。

三、觀察指標

影像學檢查、術中病理檢查符合《中國原發性肺癌診療規范(2015年版)》中對于肺癌淋巴結轉移的判定標準[9]。采用半定量法，HIF-1α及PD-L1表達水平=染色陽性細胞數比例等級×染色強度等級[10]。①染色陽性細胞數比例判斷方法：于400倍鏡下選擇10個視野，觀察每個視野計數的100個細胞中的陽性細胞數占比；②染色陽性細胞數比例等級判定標準：共分為4級，其中0級：陽性細胞<10%；1級：陽性細胞10%～25%；2級：陽性細胞26%～50%，3級：51%～75%；4級：76%～100%[11]；③染色強度判斷標準 0級：無著色；1級：淺棕色；2級：棕色；3級：深棕色[12]。表達水平<6為低表達，≥6為高表達。

分析所有患者中統計隨訪結束時所有患者淋巴轉移情況，比較轉移及未轉移患者臨床資料[包括：年齡、性別構成、BMI、TMN分期、病理分型、血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)表達水平]、影像學資料(包括：腫瘤直徑、影像學特征、病灶位置)之間的差異。分析根據HIF-1α、PD-L1對淋巴結轉移判定標準將所有患者根據兩種蛋白的表達量分別分為高表達和低表達組，并比較二組之間淋巴轉移情況之間的差異。

從患者出院開始進行為期24個月的隨訪，主要通過電話及患者來院復查隨訪，CT復查按照《中國原發性肺癌診療規范(2015年版)》的標準，如隨訪期間患者自覺病情變化可隨時到院進行檢查[9]。

四、統計學方法

結 果

一、納入研究患者的隨訪情況

截止2019年12月31日隨訪結束，92例患者完成隨訪，5例失訪，中位隨訪時間為22(14，24)個月；共發生淋巴結轉移例數36例，淋巴結轉移率39.13%。

二、HIF-1α、PD-L1表達量對NSCLC患者淋巴結轉移的影響

按照 HIF-1α、PD-L1表達量將所有完成隨訪的患者進行分組，HIF-1α高表達(n=27)，低表達(n=65)，患者的淋巴結轉移發生率分別為92.6%和26.9%，HIF-1α高表達的NSCLC患者淋巴結轉移率顯著高于低表達患者(log-rankχ2=63.052；P<0.001)。PD-L1高表達(n=28)和低表達(n=64)的淋巴結轉移發生率分別為82.1%和21.3%，PD-L1高表達的NSCLC患者淋巴結轉移率顯著高于低表達患者(log-rankχ2=39.555；P<0.001)，具體見圖1，2。

圖1 HIF-1α表達量對于NSCLC患者淋巴結轉移的影響

圖2 PD-L1表達量對于NSCLC患者淋巴結轉移的影響

三、NSCLC患者淋巴結轉移的影響因素Cox單因素分析

單因素Cox分析結果顯示， HIF-1α、PD-L1表達量、TMN分期、CEA、腫瘤直徑是NSCLC患者淋巴轉移的影響因素(P<0.05)，見表1。

表1 NSCLC患者淋巴結轉移的影響因素分析

表2 影響淋巴結轉移的Cox回歸分析結果

四、NSCLC患者淋巴結轉移的影響因素Cox回歸分析

根據單因素分析結果，以隨訪結束發生淋巴結轉移為因變量(1=是，0=否)；以 HIF-1α、PD-L1表達量(1=高表達，0=低表達)TMN分期(1=Ⅱ期，0=Ⅰ期)，CEA(實測值)及腫瘤直徑(實測值)為自變量；發生淋巴結轉移時間為時間軸進行Cox回歸分析，結果顯示， HIF-1α高表達(HR=25.790,95%CI=10.005-30.287)、PD-L1高表達(HR=16.693，95%CI=12.014-20.356)、CEA(HR=1.058，95%CI=1.013-1.106)是NSCLC患者淋巴轉移的危險因素(P<0.05)，見表2。

討 論

淋巴轉移是導致NSCLC患者疾病進展的關鍵因素，對于臨床治療效果、遠期生存率也有顯著的影響[13-14]。手術治療是目前多個指南中對于早期NSCLC患者必要治療方式，但對于術中淋巴結清掃及范圍的選擇在指南中仍需要主刀醫生進行術中判斷，通過早期檢測并結合影像學證據可以為醫生選擇手術方式提供較好的參考，同時也為后期治療方案的優化提供一定的幫助[15-16]。

以往研究顯示，HIF-1是體內參與低氧代謝下細胞型號傳導的DNA結合型蛋白，而其中的α亞體被低氧狀態誘導激活，控制HIF-1的活性并調節其表達狀態[17-18]。PD-L1則是介導機體免疫反應的重要因素，與PD-1結合后可通過ITSM募集SHP-2蛋白，促使T細胞抗原受體信號通路多個關鍵分子發生磷酸化，抑制T細胞的增殖及活性，PD-L1在腫瘤細胞表面表達是導致腫瘤細胞發生免疫逃逸的重要因素[19-20]。Zhao等[21]研究指出，EZH2抑制劑可以通過降低HIF-1α來抑制PD-L1的表達，說明二者與NSCLC的發生發展具有密切關系。本文結果提示，NSCLC患者病灶內的 HIF-1α、PD-L1表達量與其遠期發生淋巴結轉移的風險具有顯著的相關性。Samulitis等[22]研究提出，正常細胞中HIF-1α半衰期較短，而腫瘤細胞在快速大量的增殖過程中往往處于相對缺氧狀態，故HIF-1α極易被激活并維持較高的表達水平。由此可以認為，當NSCLC患者瘤細胞處于快速增殖狀態時HIF-1α會高表達，而快速增殖狀態的癌細胞也更容易發生淋巴結轉移。正常人體內活化PD-L1表達的信號通路相對較多，已經被證實的有ALK/STAT3、PI3K、IFN-γ/JAK2/IFN及MEK/ ERK/STAT1四個通路，而上述通路中多個關鍵蛋白，如STAT3、PI3K及IFN-γ等均與NSCLC的發生和發展具有密切關系，故上述通路在誘導NSCLC細胞增殖的同時，還能激活細胞表面的PD-L1表達，降低免疫系統的抗癌反應，從而導致癌細胞擴散，并發生淋巴結轉移[23-25]。

研究指出CT對于淋巴結微小轉移的判斷并無顯著優勢，而且由于早期NSCLC患者淋巴結癌轉移灶增大不顯著，通過影像學特征判斷可能與炎性或肉芽腫性病灶混淆從而導致誤診的情況發生，這也充分說明了影像學檢測在判斷NSCLC患者淋巴結轉移上的局限性[26-27]。本文顯示，HIF-1α、PD-L1表達量及CEA水平是影響淋巴結轉移的危險因素，此結果再次說明了HIF-1α、PD-L1表達量對于NSCLC患者淋巴結轉移的相關性。而Tomita等[28]研究顯示，CEA對于NSCLC患者淋巴結轉移具有一定預測及判定價值，而且CEA對NSCLC的影響力受到腫瘤直徑的影響，這與本文研究結果類似。雖然根據肺癌TMN分期標準，腫瘤直徑是判定患者TMN分期的重要因素，同時多個研究結果顯示，分期較高的患者癌細胞的侵襲及轉移性也相對較高，故發生淋巴結轉移的可能性也較大[29-30]，但本文中多數患者為早期，腫瘤直徑也相對較小，由于其他因素的共同作用將TMN分期和直徑對淋巴結轉移的影響抵消，同時本文為單中心小樣本量研究，結果可能存在一定偏倚，這也可能成為導致結果出現差異的原因。

綜上，HIF-1α、PD-L1表達量與NSCLC患者發生淋巴轉移風險存在顯著相關行，對于NSCLC患者淋巴結轉移具有預測價值，有助于NSCLC患者疾病進展的防治。