NLRP3炎癥小體在ICU獲得性衰弱大鼠呼吸肌和下肢肌中的表達

向朝雪 李福祥， 朱忠立 劉 暢 胡 健 黎俊雅 祝國蕓 宋羽希

重癥監護室獲得性衰弱(intensive care unit-acquired weakness, ICU-AW)是嚴重疾病的常見并發癥，在重癥監護病房的患者中發生率約為50%[1]。呼吸肌無力往往影響撤機，導致拔管延遲，從而延長機械通氣時間，增加住院時間。四肢肌肉功能障礙將導致生活質量下降和病死率增加[2]。由于肌肉萎縮的恢復非常緩慢，ICU-AW會導致身體機能的長期損害[3-4]；甚至有報道稱ICU-AW患者出院6個月后身體功能仍然受損[5]。

多項前瞻性研究發現，膿毒癥是ICU-AW發生的重要的獨立危險因素[6-8]。全身性炎癥反應綜合征和/或重要臟器炎癥損害過程中產生的細胞因子造成肌肉組織損傷；而蛋白質合成和分解之間不平衡最終造成吸肌和下肢肌丟失和ICU-AW的發生[9]。本文在前期的研究中成功構建ICU-AW大鼠模型，在此基礎上探討炎癥小體NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3, NLRP3)及其下游分子在膿毒癥相關呼吸肌和下肢肌中的作用和機制，旨在為ICU-AW的診治提供新的思路。

材料與方法

一、實驗材料與試劑

兔抗NLRP3、Fbx32、GAPDH購于美國Abcam公司，兔抗IL-18、IL-1β、caspase1-p20、MURF1購于北京博奧森生物技術有限公司，全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白上樣Marker、Loading buffer購于江蘇凱基生物技術股份有限公司，PCR引物、SYBRGreen Ⅰ購于北京擎科新業生物技術有限公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit購于寶生物工程(大連)有限公司；HE染色試劑盒購于北京博奧森生物技術有限公司。其它未列出試劑純度均達到分析純。

二、實驗動物及分組

5～7周齡清潔級健康雄性SD大鼠40只，體重200～240 g，購于成都達碩生物科技有限公司(生產許可證號：scxk(川)2008-24)。采用完全隨機的方法將SD大鼠分為兩組：對照組(sham組)、實驗組(膿毒血癥組)。實驗用大鼠于我院實驗中心動物房飼養，實驗中所有損傷和程序均經過西部戰區總醫院倫理委員會批準。

三、動物模型制備

采用腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1.5 ml/kg)的方法對大鼠進行麻醉，麻醉后將其仰臥固定于操作臺。實驗組(膿毒血癥組)大鼠在無菌條件下切開腹膜、暴露盲腸，擠出盲腸內空氣后，在距離盲腸末端1 cm處使用醫用真絲編織線結扎，采用12號針頭在結扎的盲腸中部單次刺孔。而后，將盲腸回置于腹腔，逐層縫合腹膜、肌肉和皮膚。術后于大鼠背部皮下組織注射生理鹽水5 ml行液體復蘇。手術過程中未使用抗生素。對照組(sham組)大鼠切開腹膜、暴露盲腸，不行盲腸結扎、穿孔。所有大鼠均在同樣的條件下進行飼養，自由進食、水。術后96 h，分離所有大鼠雙側膈肌和腓腸肌，左側膈肌和腓腸肌用4%中性甲醛溶液固定后行病理學檢查；右側膈肌和腓腸肌于液氮中凍存，用于其它實驗。

四、檢測方法

1. 肌肉組織病理檢測： 取對照組和實驗組大鼠左側膈肌和腓腸肌迅速放入4%多聚甲醛溶液中固定、脫水，常規石蠟包埋，以厚度4 μm切片，而后按照蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色試劑盒操作說明書的步驟進行HE染色，并在光學顯微鏡下觀察、拍照。采用IPP6.0圖像分析軟件測定肌纖維橫截面積，每張切片測5個視野，取平均值進行統計學分析。

2. qRT-PCR檢測： 采用qRT-PCR方法檢測右側腓腸肌、膈肌中NLRP3、Atrogin-1、MuRF1、Caspase-1、IL-1β和IL-18基因的表達(引物序列見表1)。提取右側腓腸肌、膈肌組織標本中的RNA，采用Nanodrop 2000分光光度計測定RNA的濃度和OD 260/280比值。各樣本均按照5 μg RNA相對應的體積，根據反轉錄試劑盒說明書在10 μl的反應體系中進行逆轉錄，條件為42 ℃，60 min；95 ℃，5 min。而后，按照qRT-PCR說明書要求，利用全自動熒光定量PCR儀進行PCR；反應條件為：95 ℃，2 min，95 ℃，15 s，60 ℃，30 min(40個循環)；60 ℃，5 s。以GAPDH作為內參，各目的基因的相對表達量采用2-ΔΔct法進行計算。

3. Western blot方法檢測： 采用western blot的方法檢測各組大鼠腓腸肌和膈肌組織中Atrogin-1、MuRF1、NLRP3、Caspase-1、IL-18和IL-1β蛋白的表達。分別取50 mg腓腸肌、膈肌組織標本，用T-PER組織裂解液(Thermo, 美國)進行裂解；采用BCA法測定樣品蛋白濃度。將100 μg蛋白樣品與5×蛋白上樣緩沖液充分混合后，在100 ℃條件下變性10 min。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白電泳，而后轉移至PVDF膜，于室溫條件下用5%脫脂奶粉溶液封閉2 h；在4 ℃條件下孵育一抗過夜(Atrogin-1、MuRF1、NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β抗體稀釋比1︰1 000)；采用TBST溶液洗膜后，用堿性磷酸酶標記的羊抗兔二抗(1︰5 000)在室溫條件下孵育2 h，洗膜后用Odyssey雙色紅外激光成像系統收集信號；最后，以GAPDH為內參對目的基因條帶灰度進行統計分析。

表1 目的基因qRT-PCR引物序列

五、統計學方法

結 果

一、膿毒血癥時大鼠吸肌和下肢肌形態的變化

為了明確膿毒血癥對ICU-AW時肌肉萎縮的影響，本研究首先探索了盲腸結扎穿孔術后膿毒血癥對大鼠腓腸肌和膈肌形態的影響。沿腓腸肌纖維縱行切片的結果(圖1A和D)表明，盲腸結扎穿孔術后96 h，大鼠腓腸肌中細胞核的數量減少，肌纖維排列較對照組更為疏松；而沿腓腸肌纖維的橫截面的染色結果(圖1B和E)更為清晰地展現了上述變化。此外，對膈肌標本的HE染色也觀察到了類似的變化(圖1C和F)。

二、膿毒血癥時大鼠腓腸肌、膈肌纖維橫截面積對比

明確膿毒血癥ICU-AW大鼠腓腸肌和膈肌的病理變化后，我們分析了兩組大鼠腓腸肌和膈肌橫截面積的差異。對照組大鼠腓腸肌橫截面積為(878.74±201.94)μm2，實驗組大鼠腓腸肌纖維橫截面積為(345.90±127.02)μm2，二者差異有統計學意義(P=0.018)。對膈肌纖維橫截面積的分析結果表明，對照組大鼠膈肌纖維橫截面積為(573.01±210.46)μm2，而實驗組大鼠膈肌纖維的橫截面積為(140.40±67.79)μm2，二者差異有統計學意義(P=0.028)。這一結果表明盲腸結扎穿孔術96 h后，大鼠吸肌和下肢肌纖維的橫截面積明顯減小，見表2。

圖1 盲腸結扎穿孔術后96 h大鼠腓腸肌和膈肌HE染色結果；注：A：對照組 沿腓腸肌纖維縱軸切片；B：對照組 沿腓腸肌纖維縱軸的橫截面切片；C：對照組 沿膈肌纖維縱軸切片；D：實驗組 腓腸肌纖維縱軸切片；E：實驗組 沿腓腸肌纖維縱軸的橫截面切片；F：實驗組：沿膈肌纖維縱軸切片

表2 對照組和實驗組大鼠腓腸肌和膈肌纖維橫截面積對比

三、膿毒血癥對大鼠腓腸肌、膈肌組織中Atrogin-1和MuRF-1基因表達的影響

在明確膿毒血癥導致大鼠腓腸肌和膈肌纖維萎縮的基礎上，本研究進一步探索了盲腸結扎穿孔術96 h后大鼠腓腸肌、膈肌組織中Atrogin-1和MuRF-1基因的表達變化。qRT-PCR結果表明，對照組大鼠腓腸肌中MuRF-1和Atrogin-1的基因表達量分別為0.78±0.12和0.88±0.09；而實驗組大鼠腓腸肌組織中MuRF-1和Atrogin-1基因表達量為3.24±0.20和24.19±3.81；與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。相似地，在實驗組大鼠膈肌組織中也觀察到Atrogin-1和MuRF-1基因表達量較對照組明顯升高(P<0.05)，見表3。

表3 對照組和實驗組大鼠腓腸肌和膈肌中Atrogin-1和MuRF-1基因表達

四、膿毒血癥對大鼠腓腸肌、膈肌組織中Atrogin-1和MuRF-1蛋白的表達變化

本文進一步明確了盲腸結扎穿孔術96 h后大鼠腓腸肌、膈肌組織中Atrogin-1和MuRF-1蛋白的表達變化。結果如圖2A所示，實驗組大鼠腓腸肌中Atrogin-1和MuRF-1的表達量較對照組明顯升高(P<0.05)；類似地，盲腸結扎穿孔術96 h后大鼠膈肌組織中Atrogin-1和MuRF-1蛋白表達量較對照組亦明顯升高(圖2B)，差異有統計學意義(P<0.05)。并且，在膈肌中Atrogin-1和MuRF-1蛋白表達量增加的幅度比腓腸肌更為明顯。

圖2 膿毒血癥時大鼠腓腸肌、膈肌組織中Atrogin-1和MuRF-1蛋白的表達

五、膿毒血癥時大鼠腓腸肌、膈肌組織中NLRP3及其下游分子的mRNA表達

本文檢測了ICU-AW大鼠腓腸肌、膈肌組織中NLRP3及其下游分子的mRNA表達變化，結果顯示，對照組大鼠腓腸肌中NLRP3 mRNA表達量為0.91±0.16，而其在實驗組大鼠腓腸肌組織的相對表達量為3.16±0.18，二者差異有統計學意義(P=0.0007)。對NLRP3下游分子的mRNA表達量的檢測結果表明，對照組大鼠腓腸肌中Caspase-1、IL-18及IL-1β的相對表達量分別為1.25±0.78、0.72±0.15、0.0003±0.0001；而在實驗組大鼠腓腸肌組織的表達量為18.01±0.45、1.54±0.03、0.0025±0.0006；差異有統計學意義(P<0.05)。相似地，對膿毒血癥對大鼠膈肌組織的研究結果也表明，實驗組大鼠膈肌組織中NLRP3及其下游分子的mRNA表達較對照組明顯升高(P<0.05)，見表4。

表4 膿毒血癥時大鼠腓腸肌、膈肌組織中NLRP3及其下游分子的mRNA表達

圖3 膿毒血癥時大鼠腓腸肌、膈肌組織中NLRP3及其下游分子蛋白表達

六、膿毒血癥時大鼠腓腸肌、膈肌組織中NLRP3及其下游分子蛋白表達變化

在上述結果基礎上，本文進一步驗證了ICU-AW大鼠腓腸肌、膈肌組織中NLRP3及其下游分子蛋白表達變化。如圖3A所示，膿毒血癥96 h后，大鼠腓腸肌組織中NLRP3及其下游分子Caspase-1、IL-18和IL-1β蛋白表達水平較對照組明顯升高(P<0.05)。相似地，對膿毒血癥大鼠膈肌組織的檢測結果也表明，盲腸結扎穿孔術96 h后大鼠膈肌組織中NLRP3及其下游分子Caspase-1、IL-18和IL-1β蛋白表達水平較對照組明顯升高(P<0.05)，見圖3B。

討 論

ICU-AW是一種床旁診斷，指ICU的患者在沒有確切原因的情況下發生的明顯虛弱[3]，威廉·奧斯勒(William Osler)于1892年首先描述了嚴重膿毒癥引起的“肉體快速流失”[10]，2009年被確認并更名為“重癥監護室獲得性衰弱(ICU-AW)”[3]。已有的研究結果表明膿毒癥、機械通氣、長時間制動、高血糖狀態、長時間激素及神經肌肉阻滯藥物治療等均與ICU-AW的發生有關[11]。

ICU-AW發病機制有多種理論，ICU-AW發病機制研究的動物模型制備方法也有多種，包括去神經支配-類固醇模型、廢用性模型、膿毒血癥模型、ICU模型、重癥患者體外血清激發試驗模型、兔燒傷模型、高血糖模型等[12]。本課題組在前期的研究中成功構建了膿毒血癥大鼠ICU-AW模型[13]。在此基礎上，本文探討了ICU-AW時大鼠吸肌和下肢肌溶解的情況。HE染色和分析的結果表明，膿毒血癥時大鼠腓腸肌和膈肌中肌纖維排列更為疏松，肌纖維的橫截面積較對照組明顯減小，說明吸肌和下肢肌發生了一定程度的溶解。已有的報道表明，肌肉溶解的機制非常復雜，危重病患者入ICU后不久吸肌和下肢肌中就會出現肌球蛋白重鏈(MyHC)的持續喪失[14]。MyHC和許多其他肌原纖維蛋白(如肌球蛋白結合蛋白)參與MuRF1的合成[15]，肌球蛋白D(MyoD)參與Atrogin-1的合成[16]。本課題檢測并明確膿毒血癥時大鼠腓腸肌和膈肌組織中MuRF1和Atrogin-1的表達較對照組明顯升高，從分子層面證明ICU-AW時大鼠吸肌和下肢肌可發生一定程度的溶解。

炎癥小體由感受蛋白(包括多種炎癥小體相關蛋白)、連接蛋白(凋亡相關顆粒樣蛋白)以及效應蛋白組成[17]。其中，NLRP3炎癥小體是研究較為深入的炎癥小體，由結合蛋白NLRP3、連接蛋白ASC、效應蛋白caspase-1組成。目前已明確多種內/外源性刺激可激活NLRP3炎癥小體，活化后的NLRP3炎癥小體通過NBD結構域形成多聚體，募集caspase-1并水解其非活性片段[18]?；罨蟮腸aspase-1可切割IL-1β和IL-18的前體，產生相應的成熟細胞因子，還能誘導細胞的炎癥壞死和組織細胞焦亡[19]。本課題的研究結果表明，盲腸結扎穿孔96 h后，大鼠腓腸肌和膈肌組織中NLRP3基因和蛋白表達的水平均明顯高于對照組；此結果與繼往NLRP3參與炎癥反應的結果相似[20]。在此基礎上，我們探索了NLRP3炎癥小體相關分子在ICU-AW大鼠模型腓腸肌和膈肌組織中的表達，結果表明，盲腸結扎穿孔術后96 h，大鼠腓腸肌和膈肌中Caspase-1、IL-18、IL-1β基因和蛋白表達量均明顯高于對照組，進一步說明NLRP3炎癥小體參與了ICU-AW。

綜上所述，盲腸結扎穿孔術制備的膿毒血癥模型中，吸肌和下肢肌溶解參與ICU-AW的發生；同時，本文研究結果也說明NLRP3炎癥小體參與上述過程。本文仍有不足之處，目前的研究僅限于對NLRP3炎癥小體在膿毒血癥ICU-AW大鼠模型中表達及其與吸肌和下肢肌萎縮關系的研究，尚未深入探討NLRP3炎癥小體參與ICU-AW的病理生理學機制，這是在后續研究中尚需要補充和完善的內容。