TGF-β1/Smad2信號通路參與海水淹溺肺損傷引起的細胞凋亡

段 銳 金發光

溺水是意外死亡常見的原因之一，世界衛生組織(WHO)估計，在世界范圍內，每年因溺水而死亡的人數高達4.5萬，目前仍然是一項重要的醫學和社會問題[1]。在溺水期間，氣道被堵塞且呼吸被抑制，缺氧是溺水后最主要的生理異常現象，由于呼吸暫停，溺水受害者最初表現為低氧血癥，但隨著時間的推移，會導致急性肺損傷(acute lung injury, ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)[2-4]。而具有高滲透壓的海水，可直接通過肺泡上皮引起嚴重的ALI或ARDS，并引起肺組織細胞發生凋亡[5]，但海水淹溺肺損傷(seawater induced acute lung injury, SWD-ALI)引起肺組織細胞凋亡的機制尚不清楚，有待深入挖掘。轉化生長因子-β1(TGF-β1)在多種生命活動中扮演重要角色，而Smad蛋白是TGF-β超家族的直接底物，Smad2可被TGF-β1直接激活，TGF-β1/Smad2信號通路與多種原因引起的肺損傷有關[6-7]，且參與調控細胞凋亡的過程[8-9]，但在SWD-ALI引發細胞凋亡中的作用尚未見報道。于是本研究在細胞水平上初步探討TGF-β1/Smad2信號通路是否參與SWD-ALI引發的細胞凋亡過程。

材料與方法

一、藥物與試劑

TRIpure、Super M-MLV反轉錄酶、RNase inhibitor、2×Power Taq PCR MasterMix購自北京BioTeke公司；SYBR Green購自北京Solarbio公司；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒、Western洗滌液、SDS-PAGE電泳液(干粉)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、ECL發光液購自中國wanleibio公司；PVDF膜購自美國Millipore；TGF-β1、p-Smad2、Smad2、Cleaved Caspase-3抗體購自中國wanleibio公司；Hoechst染色試劑盒購自中國Beyotime公司；細胞凋亡檢測試劑盒、MTT試劑購自中國wanleibio公司。

海水的制備：根據中國國家海洋局第三海洋研究所，海洋生化研究室提供的我國東南沿海海水主要成分配制，pH 8.2，比重1.05，NaCl 26.518 g/L，MgSO43.305 g/L，MgCl22.447 g/L，CaCl21.141 g/L，KCl 0.725 g/L，NaHCO30.202 g/L；SB431542購自中國阿拉丁公司：稱取3.8 mg的SB431542溶于1 ml的DMSO中，配制成濃度為10 mM的母液，備用。

二、動物與細胞株

1. 實驗材料： A549人肺癌細胞系(由本實驗室保存)。

2. 實驗儀器： 超純水系統(香港Heal Force公司)；-70 ℃超低溫冰箱(安徽中科美菱公司)；超凈工作臺(蘇州凈化公司)；CO2培養箱(上海力申公司)；酶標儀(美國BIOTEK公司)；熒光定量PCR儀(韓國BIONEER公司)；紫外分光光度計(美國Thermo公司)；雙垂直蛋白電泳儀(北京六一公司)；超速冷凍離心機(湖南湘儀公司)；流式細胞儀(美國BD公司)。

三、實驗方法

1. 細胞培養與藥物處理： A549細胞用含10%胎牛血清的F-12K培養基于37 ℃、5% CO2條件下進行培養。取對數期細胞接種于細胞培養板中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養24 h后，分成3組，即對照組、海水組和抑制劑組，其中對照組細胞正常培養，海水組細胞用濃度為40%的海水處理4 h，抑制劑組細胞用濃度為10 μm的SB431542預處理2 h后，加入濃度為40%的海水處理4 h，處理完畢后，收集細胞進行后續檢測。

2. MTT檢測細胞活力： 取對數期細胞接種于96孔板中，每孔4×103個細胞，設置5個復孔，待細胞貼壁后，分別加入濃度為20%、40%、60%的海水，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下處理4 h。棄去各組細胞的培養基，更換成濃度為0.5 mg/ml MTT混合液，于37 ℃、5% CO2條件下孵育4 h，棄上清后，加入150 μl DMSO避光靜置10 min，溶解細胞內形成的紫色結晶，然后在酶標儀上測定其在570 nm處的OD值。

3. 細胞凋亡的檢測: ①流式細胞術檢測細胞凋亡情況：將細胞按1×105的細胞量接種于6孔板中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養24 h后，按照細胞加藥方式處理后，收集各組細胞，1 000 g離心5 min，棄上清，加入195 μl Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，加入10 μl Propidium Iodide混勻，于室溫避光孵育15 min，隨即應用流式細胞儀進行檢測; ②Hoechst染色觀察細胞凋亡情況：將細胞按4×104的細胞量接種于12孔板中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養24 h后，按照細胞加藥方式處理后，棄去上清，PBS洗滌2遍后，加入0.5 ml固定液，室溫固定15 min，棄固定液，PBS洗滌2遍后，均勻滴加0.5 ml Hoechst染色液，染色5 min，棄染色液，PBS洗滌2遍后，封片，于熒光顯微鏡(400×)下進行觀察拍照。

4. Real-time PCR： 收集按照細胞加藥方式處理后的細胞，采用TRIpure法提取細胞中總RNA，使用紫外分光光度計測量RNA的濃度后，將其反轉錄為cDNA，作為模板，備用。取1 μl cDNA模板，加入待測基因上下游引物各0.5 μl、SYBR GREEN mastermix 10 μl和ddH2O 8 μl，于熒光定量儀進行定量分析(反應條件為94 ℃ 5 min、94 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s，4 ℃保存)。

5. Western blot： 收集按照細胞加藥方式處理后的細胞，采用全蛋白提取試劑盒提取細胞中的總蛋白，用BCA法測量其濃度后，行SDS-PAGE，轉膜、封閉后。滴加一抗(TGF-β1 1︰500、Smad2 1︰500、p-Smad2 1︰400、Cleaved Caspase-3 1︰1 000)，于4 ℃條件下過夜孵育，滴加二抗(羊抗兔IgG-HRP 1︰5 000)，于37 ℃條件下孵育45 min(注：如是普通抗體，封閉液、一抗、二抗的孵育液為5%脫脂奶粉，如是磷酸化抗體，則封閉液、一抗、二抗的孵育液為1% BSA溶液)，再進行ECL底物發光，然后用凝膠圖像處理系統分析目標條帶的光密度值。

結 果

一、不同濃度的海水對A549細胞活力的影響

分別用濃度為20%、40%、60%的海水處理A549細胞4 h后，采用MTT法對細胞活力進行檢測，結果如圖1所示，隨著海水濃度的增加，A549細胞的活力逐漸下降，其中濃度為20%海水并未引起細胞活力顯著性下降，當濃度大于40%時，細胞活力開始明顯下降，且具有統計學意義(P<0.001)。本結果中選用濃度為40%的海水進行后續實驗。

圖1 MTT法檢測細胞活力結果

二、海水引起A549細胞發生凋亡

當用濃度為40%的海水處理A549細胞時，細胞凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-3的表達水平顯著上調，且具有統計學意義(如圖4B所示，P<0.001)；采用Hoechst染色觀察凋亡情況，結果如圖2A、2B所示，海水處理后，A549細胞核呈現出致密濃染，顏色發白，提示細胞發生凋亡現象；同時我們還采用了流式細胞術對細胞凋亡情況進行檢測，對照組細胞的早期凋亡率為0.068，晚期凋亡率為0.006，而海水處理后，細胞的早期凋亡率變為0.064，晚期凋亡率變為0.220，總凋亡率顯著上升，且具有統計學意義(P<0.001)。以上結果提示SWD-ALI可引起細胞發生凋亡。

圖2 Hoechst染色觀察細胞凋亡結果(400×)

三、TGF-β1/Smad2信號通路參與海水淹溺肺損傷細胞凋亡過程

用海水處理A549細胞后，TGF-β1 mRNA與蛋白表達水平顯著上調，且用TGF-β1受體抑制SB431542處理后，TGF-β1的表達顯著下調(如圖3A、3B所示，P<0.001)，而Smad2 mRNA與蛋白表達水平無顯著性變化，但海水處理后，Smad2磷酸化蛋白的表達水平顯著上調，且抑制劑處理后明顯被恢復(如圖3B所示)。另外發現海水使A549細胞發生顯著性凋亡，但用抑制劑處理后，由海水引起的凋亡現象被顯著緩解，且具有統計學意義(如圖2所示，P<0.001)，同時抑制劑組細胞中凋亡相關蛋白的表達水平也顯著降低，趨于對照組，且具有統計學意義(如圖3B所示，P<0.001)。以上結果提示SWD-ALI可通過激活TGF-β1/Smad2信號通路，促使細胞凋亡。

討 論

在意外死亡原因的排行榜上，溺水位列第二，主要發生在兒童和青少年群體中[10-11]，溺水后果的嚴重與否主要依賴于吸入水的成分與數量[12]，具有滲透壓的海水吸入是引起ALI的重要原因之一，其主要癥狀為肺水腫和嚴重的難治性低氧血癥[13-14]。探究其癥狀的機理是開發新的治療藥物的關鍵。

圖3 TGF-β1/Smad2信號通路相關指標mRNA與蛋白表達水平；注：A：Real-time PCR檢測相關指標mRNA表達水平；B：Western blot檢測相關指標蛋白表達水平

凋亡是細胞為了維持內環境的穩定而由基因調控的程序性死亡，此過程是一個主動過程，它涉及一系列基因表達與調控的過程，是細胞的一種保護性措施。目前已知多種原因引起的肺損傷均會引起細胞發生凋亡[15-16]，Han等[5]用海水建立SWD-ALI大鼠模型及細胞模型，發現海水可激活凋亡相關蛋白Caspase-8與Caspase-3；Li等[17]采用TUNEL法觀察SWD-ALI大鼠模型肺組織時，發現肺組織細胞發生凋亡，且Caspase-3的表達水平上調；在本研究中，我們用海水處理A549細胞后，通過流式細胞術檢測發現，海水使細胞凋亡率顯著增加；Hoechst染色觀察發現海水使細胞核呈現出致密濃染，顏色發白，且數量增多；Western blot對凋亡相關蛋白cleaved Caspase-3蛋白表達水平進行檢測，發現海水使該指標表達水平顯著上調，以上實驗結果提示海水可引起細胞發生凋亡，并與前人的報道相符合。由此可見，海水淹溺肺損傷(SWD-ALI)引起細胞發生凋亡的現象比較常見，不可忽略，探索其發生的機制刻不容緩。

轉化生長因子-β1(TGF-β1)是由TGF-β超家族中重要的一員，參與多種生命活動，包括細胞生長、遷移、分化及凋亡等。研究表明，在百草枯引發的ALI中，TGF-β1被激活[18]；在脂多糖引起的ALI中，TGF-β1亦被激活[19]；同樣在本研究中，海水處理A549細胞后，細胞中TGF-β1 mRNA與蛋白水平表達顯著上調，可見TGF-β1在ALI中具有重要作用。眾所周知，TGF-β1與細胞凋亡密切相關[9，20-21]，但TGF-β1在SWD-ALI引發的細胞凋亡中的作用還未見報道。Smad蛋白是TGF-β超家族的直接底物，可將TGF-β傳遞的信號攜帶進入細胞核中，從而影響細胞中轉錄調控過程[22-23]。而Smad2可被TGF-β1直接激活，TGF-β1活化后與Smad2磷酸化形式相互作用，進而調節細胞生命活動[24-30]。同時，研究發現TGF-β1/Smad2信號通路參與地塞米松調節A549細胞凋亡的過程[8]，但TGF-β1/Smad2信號通路是否參與SWD-ALI引發細胞凋亡過程尚不清楚，本研究通過使用TGF-β1受體抑制劑SB431542預處理A549細胞后，再用海水進行處理，流式細胞術、Hoechst染色及Western blot等檢測均發現，由海水引起的凋亡現象被抑制劑顯著緩解，同時發現TGF-β1的異常上調也被緩解，而Smad2的表達無明顯變化，但其磷酸化形式的變化與預期結果一致。本次實驗結果與前人研究報道相一致，均表明TGF-β1/Smad2信號通路參與海水淹溺肺損傷引發的細胞凋亡過程。

本文結果可為探索海水淹溺肺損傷引發的細胞凋亡的機制提供一定的理論基礎，同樣也可為臨床開發有效治療藥物提供新的思路。