白藜蘆醇對小細胞肺癌C-myc基因表達的調控研究

李王平 馬李杰 潘 蕾 金發光

白藜蘆醇(Resveratrol, Res)廣泛存在于葡萄，漿果，花生和葡萄酒中，并具有多種已知的治療作用，如抗氧化、抗炎、抗凋亡及抗癌等作用[1-4]。實際上，Res可抑制惡性細胞生長并降低癌癥相關基因的表達水平，誘導細胞周期停滯和凋亡[5-7]。myc是人類癌癥中最高度擴增的致癌基因之一，包括C-myc，N-myc，L-myc，70%的人類癌癥都有myc 表達下調或上升，其中C-myc在肺癌組織中過度表達，而正常組織無表達，在小細胞肺癌中表達率增高[8-9]。研究發現C-myc 蛋白分子中有誘導凋亡活性的結構域，可雙向激活介導細胞增殖的基因和誘導凋亡的基因[10]。前期研究證實，Res可通過內源性線粒體功能障礙途徑誘導SCLC H446細胞的凋亡并可調控Bcl-2、Bc1-xL、Bax等調亡調控因子[11]。因此，本文的目的評估白藜蘆醇對易在小細胞肺癌表達C-myc基因的調節作用，探討其在小細胞肺癌中的可能抑癌機制。

材料和方法

一、實驗材料

人小細胞肺癌H446細胞由空軍軍醫大學第二附屬醫院呼吸內科實驗室提供。FBS培養基、RPMI1640培養基、RPMI1640培養基購自美國Hyclone公司，白藜蘆醇購自Sigma 公司，DMSO 購自Invitrogen 公司，胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司，BCA 蛋白定量試劑盒購自凱基公司，核蛋白/胞漿蛋白提取試劑盒購自貝博公司，HRP 標記二抗購自碧云天。主要儀器設備：細胞培養箱(美國熱電公司)，光學顯微鏡、倒置拍攝顯微鏡(蔡司公司)，低速離心機(湘儀)，酶標檢測儀(賽默飛)，一體式化學發光成像儀(天能化學發光成像系統)，實時熒光定量 PCR 儀 (羅氏) Western blot使用一抗為兔來源的抗C-myc抗體、兔來源的抗LaminA/L抗體)；相應的二抗為(山羊抗兔和山羊抗鼠)。

二、研究方法

1. 細胞培養及分組方法：(1)將對數生長期的細胞接種至6孔細胞培養板，3 ml/每孔，密度為 5×104cells/ml，每組梯度3個復孔，5% CO237 ℃進行培養；(2)實驗分組1：將白藜蘆醇分別用完全培養基稀釋至20 μg/ml，30 μg/ml，40 μg/ml，設空白對照組，給藥后培養24 h；(3)實驗分組2：將白藜蘆醇用完全培養基稀釋至30 μg/ml，分別給藥處理0、3、6、12、24 h；(4) 實驗分組3：將 NAC用完全培養基稀釋至2 mmol/L，預處理細胞1 h，將白藜蘆醇用完全培養基稀釋至35 μg/ml 再處理細胞24 h。實驗分組為：空白對照組(CK)、Res組(35 μg/ml)、NAC組(2 mmol/L)、 Res+NAC 組；(5)實驗分組4：順鉑濃度為 5 μg/ml，Res濃度為35 μg/ml，給藥處理24 h，實驗分組為：空白對照組(CK)、Res組(35 μg/ml)、順鉑組(5 μg/ml)、順鉑+Res 組；(6)收集各組細胞，抽提RNA和蛋白進行Western blot、PCR檢測。

2. Western blot檢測目的蛋白質的表達水平： 根據蛋白質提取試劑盒說明書提取細胞質、核蛋白和總蛋白樣本。使用商用試劑盒通過BCA定量分析不同組的總蛋白量。12%SDS-PAGE分離等量的變性蛋白(20 μg)，并轉移至PVDF膜上。用5%(W/V)脫脂牛奶封閉，加入的一抗(稀釋度為1︰2 000)，4 ℃孵育過夜。將膜與二抗室溫下孵育1 h。一體式化學發光儀記錄Western blot結果，拍攝照片。注：一抗分別為(小鼠來源的抗GAPDH抗體、兔來源的抗C-myc抗體、兔來源的抗LaminA/C抗體)；相應的二抗為(山羊抗兔和山羊抗鼠)。運用Image J軟件進行灰度分析，并將灰度分析整理在 Excel 工作簿中，并且作出對應的柱狀圖。

3. Real-Time PCR檢測myc基因表達： 依照以下次序進行：RNA的抽提、逆轉錄c DNA(方法按第一鏈c DNA合成試劑盒所示步驟進行c DNA的合成)、聚合酶鏈式反應(PCR，Real-time PCR所需引物使用Primer Premier 5.0軟件進行設計，內參為管家基因GAPDH)、Real time- PCR反應體系(反應液的配制按Real-time PCR反應體系要求進行)、PCR擴增條件(94 ℃ 10 min，(94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s)40個循環，72 ℃ 5 min)，最后于實時熒光定量PCR儀自動分析結果。

引物由上海生工公司合成，引物序列如下：

C-myc(Human)-RT-F：5′-CCGAAGGGAGAAGG

GTGT-3′

C-myc(Human)-RT-R：5′-CTGCGACGAGGAGG

AGAA-3′

Human GAPDH -RT-F：5′-AGAAGGCTGGGGCT

CATTTG-3′

Human GAPDH -RT-R：5′-AGGGGCCATCCACA

GTCTTC-3′

三、統計學分析

采用SPSS 23.0進行數據分析，計量數據采用均數±SD表示，組間比較采用t檢驗；以P<0.05為檢驗水平。

結 果

一、Western blot結果

1. 不同濃度 Res 給藥時各觀察指標蛋白的表達情況： Western blot 條帶觀察及灰度分析結果表明，與CK相比，不同濃度Res作用時，隨著Res給藥濃度的增加，胞漿蛋白和胞核蛋白中C-myc 表達均在Res濃度為 30 μg/ml 顯著下降，差異有統計學意義，P<0.01。并隨著濃度增高，進一步下降，組間(Res濃度為30 μg/ml和40 μg/ml)差異有統計學意義，P<0.01。P值：胞漿蛋白：20 μg/ml(P=0.3766)、30 μg/ml、40 μg/ml(P=0.00)；胞核蛋白：20 μg/ml (P=0.37837)、30 μg/ml、40 μg/ml(P=0.00)，見圖1、2。

2. Res給藥不同時間相關蛋白的表達： Western blot條帶結果及灰度分析結果表明，與CK組相比，隨著Res給藥時間的延長，胞漿蛋白中C-myc表達下降，同樣胞核中C-myc表達隨作用時間延長逐漸降低，胞核與胞漿蛋白中C-myc表達呈同向變化。P值：胞漿蛋白： 3 h(P=0.16764)、6 h(P=0.09045)、12 h、24 h(P=0.00)；胞核蛋白：3 h(P=0.09631)、6 h(P=0.37860)、12 h、24 h(P=0.00)，見圖3、4。

3. NAC 預處理后對蛋白表達的影響： 從前面的 Res 濃度及作用時間實驗結果可知，Res對C-myc蛋白表達有明顯的調控作用。而與Res組相比，NAC預處理后再給予Res的Western blot條帶及灰度分析結果表明，給予NAC預處理后，可使Res給藥后，胞漿中C-myc表達上升，即起到拮抗Res效應的作用，差異有統計學意義，P<0.01。胞漿蛋白：與CK比較Res(P=0.00)、Res+NAC(P=0.00222)、組間比較(P=0.00)；胞核蛋白：與CK比較Res(P=0.00)、Res+NAC(P=0.00)、組間比較(P=0.00201)，見圖5、圖6。

圖1 不同濃度Res作用時蛋白的表達變化(μg/ml) 圖2 不同濃度 Res作用時蛋白的表達灰度分析(μg/ml )

圖3 Res作用不同時間蛋白的表達變化(μg/ml) 圖4 Res作用不同時間蛋白的表達灰度分析 (μg/ml)

圖5 NAC預處理后對蛋白表達的影響 圖6 NAC預處理后對蛋白表達的影響

4. 順鉑與Res聯合作用對蛋白表達的影響： Western blot條帶及灰度分析結果顯示，順鉑對胞漿胞核中的C-myc蛋白表達均有調節作用，與CK相比，差異有統計學意義，P<0.01；順鉑與Res聯用后對胞漿中的C-myc蛋白表達調節作用更加顯著，呈協同效應，與Res相比，差異有統計學意義，P<0.01。但與Res相比，順鉑聯合給藥后，胞核中C-myc的表達雖進一步下降，但差異無統計學意義，P>0.05。P值：胞漿蛋白：Res(P=0.00)、順鉑(P=0.00)、順鉑+Res(P=0.00)、Res與順鉑+Res組間比較(P=0.00)；胞核蛋白：Res(P=0.01568)、順鉑(P=0.00905)、順鉑+Res(P=0.00)、Res 與順鉑+Res，組間比較(P=0.0659)，見圖7、8。

二、Real-time PCR結果

1. 不同濃度Res給藥時C-myc的表達變化： 與CK組相比，Res給藥后C-myc表達下降，并在30 μg/ml時發生明顯變化，差異均有統計學意義，P<0.01，說明Res對C-myc基因的調節與藥物濃度有關。P值：20 μg/ml(P=0.19172)、30 μg/ml、40 μg/ml(P=0.00)，見圖9 。

2. Res給藥不同時間C-myc表達水平的變化： 隨著給藥時間延長，C-myc表達開始下降，在24 h時達到最低點，與CK組相比，差異有統計學意義，P<0.01，說明Res對C-myc基因的調節與藥物作用時間有關。P值：3 h(P=0.72209)、6 h(P=0.24021)、12 h(P=0.00544)、24 h(P=0.00)，見圖10。

3. NAC 預處理后C-myc表達的變化： Real-Time PCR檢測結果提示，Res給藥可引起C-myc表達水平下降，NAC預處理后再給予Res，可發現NAC預處理對Res引起的C-myc表達下降能起到拮抗作用，差異有統計學意義，P<0.01。P值：與CK比較Res(P=0.00)、NAC+Res(P=0.00)、組間比較(P=0.00)，見圖11。

4. 順鉑聯合用藥時C-myc表達變化： 順鉑和Res均可使C-myc表達水平下調，差異有統計學意義，P<0.01；兩者聯合使用，可使其表達下調更為顯著，差異有統計學意義，P<0.01，說明兩者聯用可起到協同效果。P值：與CK比較Res(P=0.00)、順鉑(P=0.00)、順鉑+Res(P=0.00)、Res 與順鉑+Res比較(P=0.00)，見圖12。

圖7 順鉑聯合用藥時蛋白表達變化 圖8 順鉑聯合用藥時蛋白表達變化

圖9 不同濃度Res對C-myc表達水平的影響(μg/ml) 圖10 Res給藥不同時間C-myc表達水平變化(h) 圖11 NAC預處理后C-myc表達變化 圖12 順鉑聯合用藥時C-myc的表達變化

討 論

小細胞肺癌占肺癌種類的15%～20%，然而80%的小細胞肺癌診斷時已是廣泛期[12]。由于小細胞肺癌惡性程度高，倍增時間短，轉移早而廣泛，雖然對化療、放療敏感，初治緩解率高，但極易發生繼發性耐藥，容易復發，截止目前，小細胞肺癌的治療方法仍以放化療為主。一旦化療耐藥，小細胞肺癌患者的生存時間顯著縮短。小細胞肺癌的治療效果在過去的幾十年中沒有明顯改善，對于小細胞肺癌靶向治療及免疫治療的相關研究較為滯后。雖然已有一些針對小細胞肺癌靶向治療的臨床實驗，但目前尚未有明確療效的報道，部分患者使用免疫調節劑，但療效欠佳[13]。早在1997年，Jang等[14]即發現，白藜蘆醇的抗癌活性貫穿于癌癥的整個發生、發展過程中，可減少自由基形成、抑制環氧合酶、過氧化氫酶、抑制癌細胞增殖、誘導癌細胞分化和凋亡等。前期的研究結果同樣證實白藜蘆醇對非小細胞肺癌H838和H520細胞和小細胞肺癌H446細胞的增殖均有抑制作用，并提示其作用機制與誘導細胞調亡有關[11,15]。myc癌基因蛋白屬于一個所謂的“超級轉錄因子”家族，它可能調控著整個基因組至少15%的轉錄[16]。其主要下游效應包括核糖體生物發生、蛋白翻譯、細胞周期進展和代謝，有著廣泛的生物功能，如細胞增殖、分化、生存和免疫監視等[17]。正常情況下，myc家族成員的表達受到嚴格調控，但在人類癌癥中其功能經常失調[18]。小細胞肺癌基因組存在較高的基因突變率，如myc，TP53，TP73，KRAS，RB1等，但目前的研究還未能發現有明確針對小細胞肺癌的靶向藥物[19-20]。一項體內外試驗認為，SCLC基因中存在myc擴增或高表達時，可能對Aurora激酶抑制劑 Barasertib有反應[21]。因此研究小細胞肺癌與myc基因的關系，篩選可能有效的治療小細胞肺癌的藥物具有基礎研究及臨床研究價值。

本文通過Western blot和Real time-PCR兩種方法分別對小細胞肺癌細胞系H446細胞的C-myc基因表達進行了檢測，采取不同濃度、不同作用時間，以及使用NAC和順鉑進行干預對照的方式，論證白藜蘆醇對小細胞肺癌細胞系H446細胞的C-myc基因表達是否有調控作用。試驗結果表明，H446細胞中C-myc基因蛋白的表達升高，說明C-myc基因與小細胞肺癌的發生、發展關系密切，與研究報道的C-myc在肺癌組織中過度表達，在小細胞肺癌中表達率增高的研究結論相符[9]。而給予白藜蘆醇后可降低H446細胞胞核蛋白和胞漿蛋白中C-myc基因的表達水平，其表達水平變化與Res的濃度和作用時間有關，呈現濃度依賴和時間依賴的特點。給予NAC預處理后，可拮抗Res給藥引起的C-myc基因的表達水平下降程度，而聯用順鉑后，則起到明顯的協同作用。

myc癌基因家族包括3個成員，C-myc，mycn和mycl，分別編碼C-myc、N-myc和L-myc[16]。目前對L-myc的作用仍不太清楚，但研究發現，N-myc表達是在組織中是受限的，認為N-myc可以替代小鼠中C-myc的作用[22-23]。而C-myc蛋白分子中有誘導凋亡活性的結構域，可雙向激活介導細胞增殖的基因和誘導凋亡的基因[10]。研究發現myc水平適度增加可以刺激細胞和機體的生長，但過度激活時則誘導細胞自主凋亡，抗凋亡的Bcl家族成員在淋巴瘤和實體瘤中均可介導myc驅動的細胞凋亡，小鼠淋巴瘤模型證實p53可參與介導myc誘導的凋亡[24]。研究發現，腫瘤在同時表達Bcl-2和C-myc，N-myc時，侵襲作用更加明顯[25-31]。以上研究均說明myc基因與腫瘤的發生發展密切相關，且myc基因與調亡相關蛋白關系密切。前期研究證實了白藜蘆醇可誘導小細胞肺癌H446細胞的調亡，其作用機制與調亡調節蛋白有關[11,27]。本文發現白藜蘆醇可降低C-myc基因的表達水平，并有時間和濃度依賴的特點。而與順鉑聯合，可增強順鉑對C-myc基因表達水平的影響，說明白藜蘆醇可通過調控C-myc基因的表達對H446細胞的增殖起到抑制作用，而其作用機制是否與調亡有關，尚待進一步研究證實。

本文缺陷在于僅觀察了C-myc基因的表達變化，而未對L-myc和N-myc進行同步觀察，以更加深層次了解myc基因在小細胞肺癌發生、發展中的作用。此外，本文僅為細胞水平研究，尚待動物實驗對本實驗結果進行進一步驗證。