接觸蛋白-1在原發性肺鱗狀細胞癌組織中的表達及臨床意義

2020-05-07 00:34:22張瑞婕戢福云錢桂生余世龍王導新

中華肺部疾病雜志(電子版) 2020年2期

張瑞婕戢福云錢桂生余世龍王導新

肺癌是全球癌癥病死率最高的惡性腫瘤[1]。流行病學資料表明，85%肺癌是由非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)組成，包括鱗狀細胞癌、腺癌及大細胞癌，其中鱗狀細胞癌是僅次于腺癌的常見NSCLC[2]。轉移和侵襲是惡性腫瘤的常見生物學特性，是導致癌癥患者預后不良或死亡的最主要原因[3]。

接觸蛋白-1(contactin-1, CNTN-1)是免疫球蛋白超級家族接觸蛋白亞組的一員，最早發現其參與神經系統的發育[4]。近年來發現，CNTN-1能介導多種腫瘤細胞的轉移和淋巴管的生成，如口腔鱗狀細胞癌、胃癌、食道癌、肺腺癌、乳腺癌等[5-10]。然而，CNTN-1基因在肺鱗狀細胞癌中是否表達及其表達是否與肺鱗癌細胞侵襲和轉移相關尚未報道。本研究通過免疫組化的方法檢測CNTN-1在原發性肺鱗狀細胞癌患者和人正常肺泡上皮組織中的表達情況，進而探討CNTN-1表達與患者臨床病理參數的關系。

資料與方法

一、臨床資料

選取2018年6月至2018年12月經陸軍軍醫大學第二附屬醫院病理科確診為原發性肺鱗狀細胞癌手術標本石蠟切片63例及人正常肺泡上皮組織石蠟標本20例，所有患者術前均未接受化療或放療。63例原發性肺鱗狀細胞癌患者中，男性患者54例，女性7例。患者年齡分布為38～75歲，中位年齡59歲。按2018年美國國立綜合癌癥網絡發布的指南[11]對入選肺鱗狀細胞癌患者行TNM分期：Ⅰ期39例，Ⅱ期11例，Ⅲ期10例，Ⅳ期1例。術前淋巴結轉移陽性18例，陰性21例；術后淋巴結轉移陽性8例，陰性20例，見表1。

二、主要儀器，試劑及來源

無水乙醇、二甲苯及30%過氧化氫溶液均購于我院中心實驗室試劑庫；兔抗人CNTN-1多克隆抗體購于美國Abcam公司；檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)購于北京中杉生物技術有限公司；DAB顯色試劑盒購于邁新生物公司；蘇木素染液、中性樹膠購于北京鼎國生物技術有限公司；光學顯微鏡、恒溫水浴箱、染缸、高壓鍋均由陸軍軍醫大學附屬第二醫院中心實驗室提供。

三、實驗方法

對石蠟樣本進行連續切片，經二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、PBS緩沖液沖洗3次后，采用檸檬酸鹽高壓法進行抗原修復；PBS緩沖液沖洗3次，用3%過氧化氫溶液滅活內源性過氧化物酶，5%牛血清蛋白中封閉非特異性染色位點，加一抗稀釋液在4 ℃條件下孵育過夜；PBS緩沖液沖洗3次，加辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液在37 ℃條件下孵育1 h；PBS緩沖液沖洗3次，依次經DAB顯色、蘇木素復染、鹽酸酒精分化、蒸餾水反藍及封片后，在光學顯微鏡下觀察。CNTN-1的表達水平由兩位病理科專家在未知臨床病理資料情況下讀取結果并評定，評定標準：以細胞膜和細胞漿出現棕黃色顆粒為CNTN-1的陽性染色，高倍鏡下(×200)隨機選取5個視野，根據陽性細胞數百分比及染色強度分別計分并判定染色結果，染色強度等級評分如下：無染色(0)，淡染色(1)，棕黃色(2)，棕褐色(3)。陽性細胞百分比計數如下：0(0%)，1(1～25%)，2(26～50%)，3 (>50%)。根據染色強度和陽性細胞百分比計算HScore評分(HScore=陽性細胞百分比X(染色強度+1))[12]。

表1 CNTN-1的表達與肺鱗癌患者臨床病理參數之間的相關性 [n(%)]

注：a：χ2檢驗或Fisher確切概率法；b：患者吸煙年包數的中位數作為界限值；c：資料分析時已排除無腫瘤組織切片；d：患者術后應用順鉑或卡鉑為基礎的輔助化療

四、統計學方法

選用SPSS13.0軟件包進行統計處理。所有計數資料均以例數和構成比(%)表示，采用χ2檢驗或Fisher精確概率法進行組間差異比較，P<0.05表示差異有統計學意義。

結果

一、 CNTN-1在正常肺泡上皮組織和原發性肺鱗狀細胞癌組織中的表達

免疫組化結果顯示，CNTN-1在原發性肺鱗狀細胞癌組織中廣泛表達(圖1A-1F)，在正常肺泡上皮細胞中不表達(圖1G和1H)。由圖1可見，CNTN-1的表達定位在細胞膜和細胞漿。63例原發性肺鱗癌組織標本中，陽性表達35例，陰性表達26例，2例因石蠟切片上的標本脫落而無癌組織，陽性率為55.56%(35/63)。其中，陽性中低表達13例(20.63%，13/35)，中表達19例(30.16%，19/35)，高表達3例(4.76%，3/35)。免疫組織化學半定量分析結果表明，CNTN-1在肺鱗癌組織中的表達顯著高于正常肺泡上皮組織。

二、 CNTN-1表達與原發性肺鱗狀細胞癌患者臨床病理參數的關系

χ2檢驗或Fisher精確檢驗統計結果顯示，CNTN-1的陽性表達與原發性肺鱗癌患者吸煙(P=0.023)及術前淋巴結侵襲顯著相關(P=0.01，表1)，與性別、年齡、腫瘤組織的分化級別、分期及腫瘤大小無關，而其差異表達與患者的所有臨床病理參數均無相關性，見表2。

討論

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，盡管近年來總體發病率有所下降，但仍然是癌癥患者死亡率最高的惡性腫瘤[13]。肺鱗狀細胞癌是NSCLC的第二常見病理類型[14]，腫瘤細胞的遷移和侵襲是導致其預后不良甚至死亡的重要因素[15]。CNTN-1是免疫球蛋白超級家族接觸蛋白亞組的一員。CNTN-1最初是在測定植物凝血素結合糖蛋白Gp135的氨基酸序列時發現的[4]。隨后的研究發現，該蛋白是一個糖基磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidylinositol, GPI)錨定的神經細胞黏附分子(neural cell adhesion molecule, NCAM)，在各種神經組織中差異表達，參與神經系統的發育和小腦形態的發生等[16]，而CNTN-1突變則可造成致死性、先天性肌病[17]。CNTN-1在神經系統發育中的主要功能是促進神經軸突的推進導向作用[18-19]。CNTN-1在正常肺上皮細胞中沒有表達。2006年，CNTN-1的上調表達被意外發現與肺腺癌細胞的侵襲和轉移密切相關。體外采用siRNA沉默CNTN-1表達后，肺腺癌細胞的侵襲、遷移及黏附均受到抑制，并且，siRNA沉默組移植瘤重癥聯合免疫缺陷(severe combined immune deficiency, SCID)小鼠不僅在移植瘤、肺內轉移結節大小上顯著性小于對照組，并且在生存時間上也顯著性優于對照組[5]。CNTN-1的上述生物學效應是其作為VEGF-C/Flt-4軸的下游效應分子而發揮作用的[20]。后續的研究進一步證實，CNTN-1上調表達不僅可增強肺腺癌侵襲性[21]，并可促進食道癌的發展和胃癌的淋巴浸潤[6, 22-24]。

目前關于肺鱗狀細胞癌組織中CNTN-1表達情況及其與患者臨床病理參數之間的關系，在國內外尚未見相關報道。本研究通過采用免疫組織化學技術分別檢測了63例原發性肺鱗癌組織和20例正常肺泡上皮組織中CNTN-1表達情況，研究發現，CNTN-1在正常肺泡上皮細胞中不表達，但在原發性肺鱗癌中廣泛表達，這提示CNTN-1可能參與肺鱗癌發生發展的病理過程，但具體的調控機制需要進一步的實驗研究。