蛹蟲草復合誘變育種與溫度馴化研究

趙 南，王松濤，劉慶國，鄒亞男，陳 勇

(1.南京高新工大生物技術研究院有限公司，江蘇 南京 210032；2.瀘州品創科技有限公司，四川 瀘州646000；3.南京工業大學，江蘇 南京 211816)

蟲草素是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗生素，具有抑菌、抗腫瘤、免疫調節和抗炎癥等生物學活性，由一個3-脫氧的核糖和腺嘌呤通過糖苷化連接而成。蟲草素有化學法和生物法兩種合成方法，其中化學合成工藝主要是以腺苷為原料，通過將腺苷的3′-位羥基溴代，再用自由基還原去除3′-位的溴制備蟲草素。化學合成蟲草素的過程中副產物較多，分離純化的難度較大，因此目前蟲草素合成多采用生物法[1]。

蛹蟲草是生物法制備蟲草素重要的菌株之一。傳統的生物法制備是人工子實體固態培養，發酵工藝規模性體量大，耗時耗力，單位空間產量較低[1]。另一種生物合成的方法是通過液態淺層發酵，采用液體發酵技術培養蛹蟲草菌絲體，其菌絲體生長迅速，生產周期短，蟲草素產量高，提取工藝較為簡單。此發酵工藝是目前大規模生產蟲草素的主流方法[2]。

液體發酵法生產蟲草素最為關鍵的因素是菌株活性。傳統菌株篩選法是以菌落形態或目標產物濃度為指標，采用大量平板培養或搖瓶發酵培養進行篩選，存在勞動量大、周期長和成本高等缺點[3]。高通量篩選技術具有自動、微量和高效等優點，已廣泛應用于微生物菌株選育，大幅提高了高產菌株篩選效率[4-7]。目前蛹蟲草誘變方法研究較多，如硫酸二乙酯(DES)[8]和氯化鋰(LiCl)[9]等化學誘變和γ射線誘變[10]、離子束誘變[11]、原生質體紫外(UV)誘變[12]等物理誘變；另外也有不少復合誘變，如 UV-DES(硫酸二乙酯)[13]、LiCl-UV[14]和60Coγ-UV[15]等。但鮮見有關高通量篩選和復合誘變技術相結合選育蟲草素高產菌株的研究報道。另外，由于蛹蟲草發酵溫度較低，能耗較大，發酵周期仍較長，蟲草素產率不理想，嚴重制約了其大規模生產。因此，本文利用紫外-常壓室溫等離子體復合誘變提高蛹蟲草正突變概率，通過多孔板高通量篩選提高蟲草素高產蛹蟲草菌株篩選效率，并采用溫度梯度馴化獲得耐高溫的高產蟲草素菌株，以期為蛹蟲草高產菌株的選育提供一種高效的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與器材

蛹蟲草CICC 14014，購自工業微生物保藏中心。Cellulase購自Solarbio 公司(日本) ； 蝸牛酶和溶壁酶均購自SIGMA；蟲草素標樣購自Sigma公司(美國) ；葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、酵母浸粉、腺嘌呤和甘氨酸等試劑為國產分析純；進口酵母粉和蛋白胨均為OXOID。SX-700立式全自動滅菌鍋購自TOMY公司；ZQZY-CF震蕩培養箱購自上海知楚儀器有限公司；SW-CJ-1BU超凈臺購自蘇州安泰空氣技術有限公司。另有GENESYS 10S UV-Vis紫外可見分光光度計、Molecular Device QPix 420 全自動菌落挑選儀、Agilent1200高效液相色譜儀(HPLC)等儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的制備 固體培養基：土豆汁(將200 g新鮮土豆切塊，定容至1 L，煮沸30 min，過濾)、葡萄糖15 g、磷酸二氫鉀2.5 g、七水硫酸鎂2 g，瓊脂18 g，定容至1 L。

原生質體培養基：向固體培養基中加0.5 mol/L的蔗糖。

種子培養基：葡萄糖40 g/L、蛋白胨12 g/L、酵母粉10 g/L、磷酸氫二鉀0.55 g/L、磷酸二氫鉀0.55 g/L、無水硫酸鎂0.2 g/L，用 5 mol/L鹽酸調節 pH 至 6.0。

發酵培養基：向種子培養基中加4 g/L的腺嘌呤。

1.2.2 原生質體的制備 刮取一環蟲草菌絲體于固體培養基上，25 ℃培養 4～6 d，菌絲體長好后收集菌絲體。用Miracloth濾布過濾得菌絲體。刮取1勺濕菌絲體置于30 mL裂解酶液[0.6 mol/L NaCl，2%(v/v) 纖維素酶、5 g/L蝸牛酶和溶壁酶]，25 ℃、160 r/min酶解2～3 h，2 h后每隔0.5 h取樣用顯微鏡觀察，待絕大部分菌絲形成圓形結構后，用Miracloth濾布過濾收集濾液，4000 r/min離心5～10 min，棄上清得原生質體沉淀；用0.6 mol/L氯化鈉漂洗2次后重懸，制得原生質體懸液，備用。

1.2.3 UV-ARTP復合誘變 用移液槍取原生質體懸液4 mL置于無菌培養皿中，在紫外(功率30 W，距離40 cm)下分別照射 0、1、2、3、4、5、6 min，然后稀釋涂布于原生質體培養基平板，每個時間設置3個平行，制作致死曲線，取致死率70%的時間點作為復合誘變中紫外照射時間。取紫外照射過的原生質體懸液10 μL均勻涂布在滅菌載片表面，將裝有載片的平皿轉移至提前滅菌的ARTP誘變儀工作腔中。在工作功率120 W、工作氣流10 SLM、照射距離2 mm條件下設置照射時間0、10、20、30、40、50、60 s。將處理過的帶菌載片于1 mL生理鹽水的EP管中充分混勻，稀釋涂布于再生平板，每個時間設置3個平行，置于25 ℃下培養3～5 d。致死率(DR)公式：DR(%) =(C0-Ct) /C0×100%。

其中：C0為初始原生質體再生菌落數；Ct為誘變后再生菌落數，單位均為cfu/mL。

1.2.4 96孔板高通量初篩與三角瓶復篩 用全自動菌落挑選儀挑取誘變后的單菌落(復合誘變30、40、50 s的平板菌落各30個)接入裝有固體培養基的96孔深孔板，于25 ℃培養5～7 d，隨后轉接到96孔深孔板，每個孔裝1 mL的種子培養基，置于溫度25 ℃、轉速 210 r/min的震蕩培養箱中培養3 d；再按接種量12%轉接到裝有發酵培養基的多孔板中，裝液量同樣為1 mL；然后置于25 ℃的培養箱中靜置發酵28 d。根據發酵結束后蟲草素測定結果，將預先保藏的對應高產蟲草素菌株用斜面活化后，接入500 mL無菌三角瓶(裝液量100 mL)，于 25 ℃、210 r/min 條件下培養3 d，然后按10%的接種量接入發酵培養基，于25 ℃條件下靜置培養 28 d。每個菌株復篩做3個平行。

1.2.5 遺傳穩定性檢測 將復篩的高產突變菌株連續傳代10次，每隔1代分別進行三角瓶發酵試驗，測定菌體干重和蟲草素產量，以評估菌株的遺傳穩定性。

1.2.6 溫度梯度馴化 將復篩的高產突變菌株進行涂布培養，25 ℃下培養2～3 d，挑取較大的單菌落轉至新的平板，26 ℃下傳代2次，進行涂布培養；挑取較大的單菌落轉至新的平板，27 ℃下進行2次傳代；依此進行，最終培養溫度為30 ℃。每個溫度水平挑取菌落進行液體淺層發酵。

1.2.7 蟲草素檢測方法 取發酵液樣品10 mL，離心取上清液，稀釋后用HPLC檢測蟲草素含量。色譜柱：Sepax HP-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，120 ?；檢測器：紫外波長254 nm；柱溫：30 ℃；流動相：甲醇∶磷酸二氫鉀=25∶75；流速：0.8 mL/min；進樣量：20 μL。

2 結果與討論

2.1 復合誘變

原生質體懸液經紫外輻照后，取樣稀釋并涂布于平板培養，根據菌落數量計算紫外誘變致死率。由圖1可知，蛹蟲草菌株致死率隨著輻照時間的增加而提高，輻照4 min時致死率達到 80%左右；輻照5 min時致死率超過90%。研究表明，致死率與正突變呈現負相關關系，即大劑量或長時間誘變突變幅度較大，但正突變較少；而小劑量或短時間輻照誘變突變幅度較小，但相應的正突變較多[16]。近年研究發現，采用70%～80%致死率的誘變劑量效果最佳[17,18]。故本研究取照射4 min為紫外誘變時間。

紫外照射4 min后，進行ARTP誘變處理。ARTP誘變育種的原理是其發出的等離子體流作用于微生物遺傳物質，對其產生強烈的畸變作用，使得微生物的基因序列和代謝網絡發生較大的變異[19]。同時，具有較高活性的粒子能夠改變微生物遺傳物質的分子結構，而菌株SOS自動修復機制進一步提高有利突變的出現幾率[20]。

由圖2可知，ARTP照射30 s，致死率就達80%，50 s可達90%以上。一般復合突變效果優于單一誘變效果，為了提高篩選正突變率，將ARTP處理30～50 s的菌落作為后續初篩對象。因此選擇 UV 輻照4 min后ARTP 處理 30～50 s作為初篩的誘變條件。

UV-ARTP復合誘變菌株經過96孔板發酵初篩，共挑取近300個菌落，進行多孔板種子培養和靜置發酵。結果如圖3所示，蟲草素濃度主要集中于4～6 g/L。分別從對應的復合誘變處理30、40、50 s的高產菌株中，各取10個菌落進一步進行搖瓶發酵復篩。如表1所示，UA30-3、UA40-6、UA40-10、UA50-6蟲草素產量均超過5.5 g/L，其中，UA40-6的蟲草素產量達到5.98 g/L，超過出發菌株146%(出發菌株的蟲草素產量為2.43 g/L)。利用96孔板和全自動菌落挑選儀相結合的高通量篩選法與傳統搖瓶篩選方法相比，實驗操作簡單方便，大幅降低了實驗人員的工作量，顯著縮短了菌株篩選周期。

圖1 紫外誘變致死曲線

圖2 UV-ARTP復合誘變致死曲線

2.2 遺傳穩定性驗證

將誘變后的高產菌株UA40-6菌株進行連續傳代培養，每2代分別進行種子培養和液體淺層發酵驗證，結果如圖4所示。蛹蟲草高產突變菌株經10次傳代，發酵濃度均保持在6.0 g/L左右，與未傳代的突變菌株發酵水平相比，差異不顯著，這與湯佳鵬和汪建雄的研究結果較為一致，結果說明復合誘變獲得的高產突變株具有良好的遺傳穩定性。

表1 復篩菌株產蟲草素情況(選取蟲草素發酵濃度大于4.5 g/L)

圖3 初篩產量分布

圖4 突變株UA40-6 的遺傳穩定性

2.3 溫度馴化

首先將菌株 UA40-6分別在25、26、27、28、29、30 ℃中進行固態培養，結果如圖5所示，在26 ℃和27 ℃下菌體生長較好，28 ℃下開始出現明顯異常。通過發酵驗證發現(圖6)，26 ℃發酵效果最好，28～31 ℃發酵的產量呈現明顯下降趨勢，這與李居寧的研究結果[21]較為一致。該結果說明蛹蟲草對高溫較為敏感。

隨后將誘變菌株 UA40-6依次在26、27、28、29、30 ℃中進行溫度馴化， 馴化結束后進行發酵驗證。如圖7所示，在28 ℃環境下蟲草素產量達6.56 g/L，相比于誘變初始菌株產量提高了近10%，相比于未馴化菌株同溫度下發酵產量提高了約26%。結果說明馴化后的誘變菌株活性明顯提高。

圖5 不同培養溫度對菌體生長的影響

圖6 不同發酵溫度對蟲草素產量影響

圖7 溫度梯度馴化對蟲草素產量的影響

一般地，溫度梯度馴化是很有效的微生物育種方法，雖然馴化過程耗時，但馴化效果較好，具有方向性好和遺傳性穩定等優點[22]。通過溫度馴化后的高產蛹蟲草菌株在平板培養無顯著變化情況下，菌株的適應溫度從25 ℃提高至28 ℃，發酵產量也明顯提高，這將更有利于工業化生產。

3 結論

以蛹蟲草CICC14014菌株為出發菌株，經紫外和ARTP復合誘變原生質體，獲得了超過50%以上高產蟲草素菌株(4～6 g/L)，與出發菌株發酵產量(2.43 g/L)相比有明顯提高。同時利用96孔板高通量篩選和搖瓶復篩方法獲得了4株具有較高產量的蟲草突變株，蟲草素發酵濃度均大于5.5 g/L。在此基礎上，對其中高產菌株 UA40-6進行傳代培養驗證，發現其遺傳穩定性較強，發酵濃度維持在6 g/L左右，沒有明顯下降趨勢。結果說明 UV 和 ARTP復合誘變并結合高通量篩選可快速獲得穩定性好的高產菌株。

另外，對復合誘變菌株采用溫度梯度馴化，經過10輪馴化作用，誘變菌株可耐28 ℃，相比于初始發酵溫度提高了3 ℃，最終產量可達6.56 g/L，較初始發酵水平有明顯提升。發酵溫度的提高有利于降低生產中的冷卻能耗，同時產量的提高進一步降低生產成本，對蟲草素生產具有較高的應用價值。