植物WRKY轉錄因子在非生物脅迫下的研究進展

尚 靜，張愛冬，張圣美，劉曉慧，查丁石，吳雪霞*

(1.上海海洋大學 水產與生命學院，上海 201306；2.上海市農業科學院 園藝研究所，上海 201403)

植物正常的生長、發育和繁殖需要適宜的環境條件。然而，在植物生命周期中，植物體不可避免地要應對各種不穩定的非生物環境條件，包括高溫、低溫、干旱、鹽脅迫、重金屬含量過高、營養供應少和光照不足等。這些因素可能發生在植物生長的各個時期，進而限制其生長發育，甚至使植物不能完成生活史。對于農作物和園藝作物而言，這些因素更會影響其產量和品質，對農業經濟造成嚴重損失。

在自然界中，植物經過了長期的適應與進化，形成了一系列機制以適應和抵御各種逆境脅迫[1]。轉錄因子在調控下游基因表達，協調信號途徑間的相互作用中發揮了重要的作用[2]。隨著現代分子生物學的不斷發展，許多重要的植物轉錄因子被發現并進行了深入研究。WRKY家族是植物最大的轉錄因子家族之一，其調控范圍涵蓋植物生長發育和逆境響應等多種生理活動[2]。與生物脅迫相比，對WRKY轉錄因子在非生物脅迫下的功能研究起步較晚[3]，但近年來多個研究表明，WRKY轉錄因子在植物非生物脅迫下同樣扮演著重要的角色，因此越來越受到研究者們的關注[4]。本文主要對近年來植物在非生物脅迫下WRKY轉錄因子發揮的功能做一概述。

1 WRKY轉錄因子的一般特性

1.1 WRKY轉錄因子的結構特點與分類

WRKY轉錄因子是一類與DNA結合，進而影響植物生長發育的蛋白。WRKY轉錄因子至少含有一段60個左右的高度保守的氨基酸序列[5]，其中靠近N末端有1個七肽WRKYGQK，具有高度保守性，故而得名。WRKYGQK作為WRKY轉錄因子的核心序列，Q更容易發生變異，W、K和Y是保守的[6]。在其C末端有一個鋅指結構(Zinc-Finger Motif)，其一般組成為Cx4-5Cx22-23HxH或Cx7Cx23HxC型的鋅指結構[7]，主要介導了WRKY轉錄因子與目標DNA序列的特異性結合。N末端WRKY結構域雖然不具有DNA結合活性，但可以促進C末端WRKY結構域與靶基因的特異性結合[8-9]。根據WRKY結構域的數目和鋅指結構特征，可將WRKY家族分為3個亞家族：第Ⅰ亞家族含有2個WRKY結構域，第Ⅱ亞家族含有1個WRKY結構域和C2H2型鋅指結構，第Ⅲ亞家族含有1個WRKY結構域和C2HC型鋅指結構[10]。其中第Ⅱ亞家族又根據氨基酸核心序列不同，被細分為5個亞組。

亮氨酸拉鏈(Leucine Zipper,LZ)是某些WRKY轉錄因子常見的氨基酸結構域之一。這類轉錄因子有一段特殊的α螺旋，在此類α螺旋中頻繁出現亮氨酸且出現在α螺旋同側，直線排列成一條疏水帶，2個轉錄因子就靠各自疏水帶間的疏水相互作用結合到一起，形成同源或異源二聚體即為亮氨酸拉鏈[11]。亮氨酸拉鏈本身并不與DNA結合，而是通過其氨基端上一段堿性區來與序列結合，若含亮氨酸拉鏈的轉錄因子未形成二聚體，堿性區對DNA的親和力將會明顯下降。因為此類轉錄因子與DNA結合是以其堿性區和亮氨酸拉鏈結構作為整體來發揮作用的，所以此類結構又經常稱為堿性亮氨酸拉鏈(Basic-Leucine Zipper)。

除此之外，大部分WRKY轉錄因子還具有脯氨酸富集區、谷氨酸富集區、絲氨酸/蘇氨酸富集區、激酶結構域和TIR-NBS-LRRs等結構[12]，這些結構的存在使得WRKY轉錄因子在控制基因表達時能扮演多重角色。

1.2 WRKY轉錄因子的起源

WRKY轉錄因子主要存在于高等植物中。根據已公開的WRKY基因序列，編碼2個WRKY結構域的部分基因序列是從原生真核生物藍氏賈第鞭毛蟲、盤基網柄菌和衣藻中拷貝而來[12]，這為WRKY轉錄因子的進化提供了依據。在以上3個亞家族中，第Ⅰ亞家族通常被認為是WRKY轉錄因子的祖先。隨著WRKY保守結構域的丟失，產生WRKY轉錄因子的第Ⅱ亞家族；因植物生存的需要，WRKY轉錄因子C端鋅指結構在第Ⅱ亞家族的基礎上發生突變，形成了第Ⅲ亞家族[2]。

1.3 WRKY轉錄因子的作用途徑

1.3.1 與目標DNA結合 在所有研究過的可能受WRKY轉錄因子調節的基因的啟動子中，都能發現(T)TGAC(C/T)序列，稱為W-box[13]。WRKY轉錄因子通過特異性地與靶基因啟動子W-box順式元件相結合，在級聯反應中充當轉錄激活劑或抑制劑[9]。水稻OsWRKY47能夠與啟動子區的順式作用元件直接結合，以正向調控水稻抗旱[14]。

1.3.2 與蛋白質互作 WRKY轉錄因子可以通過與不同蛋白間的相互作用，來實現其在不同逆境脅迫中相應的應答功能。如：酵母雙雜交實驗表明擬南芥AtWRKY40和AtWRKY60蛋白，AtWRKY36和AtWRKY38蛋白之間互作[15]。VQ蛋白多次被報道作為WRKY蛋白的共同作用因子參與到基因表達調控中[16]。Hu等發現AtWRKY8與VQ9通過相互拮抗調控植物的耐鹽性，鹽脅迫使得AtWRKY8基因表達量上調，突變體則表現出對鹽敏感的表型，相反vq9突變體則表現出耐鹽性[17]。李琪等在對擬南芥的研究中發現，WRKY72可能與自身及一些近源WRKY轉錄因子互作,以多聚體的形式發揮其轉錄抑制子的功能,并參與特定的非生物脅迫相關的信號轉導過程[18]。值得一提的是，WRKY轉錄因子還可以結合到自身啟動子序列的W-box上，進行自調節和交叉調節。染色質免疫沉淀(ChIP)研究顯示PcWRKY1能結合其自身以及PcWRKY3啟動子的W-box[19]。

1.3.3 參與調控信號網絡 非生物脅迫會誘導WRKY轉錄因子并觸發信號傳遞網絡以改善植物的抗逆性[13]。研究表明，MAP激酶級聯系統會響應外界環境信號，MAP激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)通過修飾一些WRKY蛋白來調節它們的功能。MAPK是近年來被廣泛研究的信號轉導分子，該系統由MAPK、MAPK激酶(MKK)和MAPKK激酶(MEKK)構成(圖1)。外界信號經過該系統可被逐步放大并傳遞到細胞內，引發生化和生理反應[20]。WRKY40可以直接抑制ABA響應基因的表達，如WRKY40能夠與WRKY18、WRKY60相互作用影響植物的ABA水平和非生物脅迫[21]。閆慧茹[22]研究發現，GhWRKY17超表達植株在種子萌發期和萌發后的生長對ABA敏感，但對ABA調控的氣孔關閉不敏感，導致較高的失水率從而對干旱敏感，表明GhWRKY17通過ABA信號途徑參與植物的干旱脅迫反應。

圖1 WRKY轉錄因子介導的植物應答反應模式圖[20]

1.3.4 迅速多向調控 WRKY轉錄因子基因是通過誘導表達的，不依賴于從頭合成的調控因子，因此具有快速、瞬時的特點[3]。有的WRKY轉錄因子只受一種脅迫因子的誘導，有的卻同時受多種脅迫因子誘導，如在水稻中WRKY57基因受干旱、高鹽和PEG誘導，將WRKY57在擬南芥中高表達可顯著提高其對上述3種逆境的耐受性[23]。同一種脅迫也可能誘導多種WRKY轉錄因子表達。如Insaf等在對南瓜WRKY基因的研究中發現，24個CmWRKY基因對水分條件有反應，其中3個基因會在缺水條件下上調[24]。一個轉錄因子可能對應多種逆境，一種逆境也可能對應多個WRKY轉錄因子，如此形成一個網狀調控系統，體現出植物調控非生物脅迫相關基因過程的復雜性和多樣性。

2 非生物脅迫下WRKY基因的功能

植物在生長過程中，要應對不斷變化的外界環境。當環境條件超出植物能承受的區間，就會發生逆境脅迫。在逆境條件下，植物的生理生化過程會發生相應的改變。逆境脅迫可以分為生物脅迫和非生物脅迫兩大類，非生物因素對植物性狀的影響較生物因素更為顯著[25-26]。近年來有研究表明，WRKY轉錄因子在溫度脅迫、水分脅迫、鹽脅迫等非生物逆境中起到了重要的調控作用。

2.1 溫度脅迫

溫度在植物生長發育過程中起著非常關鍵的作用,當環境溫度超出了植物的適應范圍,就會對植物形成脅迫,溫度脅迫分為高溫脅迫和低溫脅迫，都對植物的生長不利[27]。溫度脅迫被認為是一個重要的非生物脅迫，它會影響植物光合作用、氧化還原反應、細胞膜流動性、細胞滲透壓、蛋白質和核酸的結構等生理和代謝反應等[28]。對植物而言，高溫和低溫都是限制其生長發育的主要不利因素。大量相關研究工作揭示了WRKY轉錄因子參與了植物響應高溫脅迫和低溫脅迫[29-30]。

高溫脅迫會損傷細胞膜并打破植物體內的活性氧平衡等，影響植物的結構和功能[31]。同時高溫還會抑制類囊體的活動，尤其是光系統Ⅱ的反應中心[32]?？踪毁籟33]在對文心蘭高溫處理后12 h發現OnWRKY1表達量升高，說明OnWRKY1是一個與抗熱相關的轉錄因子。Dang等[34]研究發現,辣椒葉片的CaWRKY40基因受高溫誘導后表達會顯著上調。申磊[35]在研究CabZIP63和CaWRKY40兩個轉錄因子時發現，前者可以結合后者基因的啟動子，在對高溫高濕脅迫下的應答過程中，這種結合會被加強。

低溫脅迫也會導致植物光合作用效率下降，植物在受到低溫脅迫后，首先傷害的是細胞膜系統，進而對植物光合色素含量、葉綠體亞顯微結構、光合能量代謝、PSⅡ活性以及一系列重要生理生化過程都產生影響，最終出現植株損害嚴重或者死亡[36-37]。袁玉輝等[38]在對芥菜型油菜轉錄因子BjWRKY33的研究中表明，冷害(4 ℃)會誘導葉片中BjWRKY33基因表達量升高。小金海棠中MxWRKY基因在低溫處理(2 ℃)下也會被誘導上調表達[39]。在低溫脅迫條件下，8個茶樹WRKY轉錄因子在處理72 h內顯著上調后又顯著下降，總體呈上升趨勢[40]。在低溫條件下，VaWRKY33過量表達的葡萄愈傷組織顯示出比空載體愈傷組織更低的低溫放熱值，這表明VaWRKY33可以增強葡萄愈傷組織對冷的耐受性[41]。Zheng等[42]在辣椒中挑選了16個WRKY基因進行研究，發現大多數WRKY基因在冷脅迫下上調，CaWRKY6和CaWRKY42在低溫脅迫下被誘導表達，且在處理后6和3 h分別達到峰值。

2.2 水分脅迫

水分脅迫對植物造成傷害主要是因為土壤水分供應不足，從而使植物葉片相對含水量及水勢降低，且使氣孔開度降低，從而影響呼吸作用、光合作用和正常生長發育[25]。WRKY基因在植物中的過表達對抗旱性的影響已經有了廣泛的研究[43]。He等[44]在擬南芥中過表達TaWRKY33發現，當植株受到干旱脅迫時，其葉片失水率較野生型擬南芥低。Liu等[45]研究發現，將PbrWRKY53在煙草和烏蘇里梨中的過表達，可以增強兩者對干旱脅迫的耐受性，轉基因植株表現出比野生型植株更高的含水率、抗氧化酶活性和代謝物含量，更少的活性氧成分。

2.3 鹽脅迫

鹽脅迫會導致滲透效應和鹽的特異性效應，從而對植物造成傷害[46]。張惠媛等[47]發現，TaWRKY33會受鹽脅迫的誘導表達，轉入擬南芥和小麥后均能提高兩者的耐鹽性。石文艷[48]從大豆中克隆得到的GmWRKY12在擬南芥中過表達后發現，過表達的擬南芥的根長在NaCl處理下比對照的長、葉面積也更大，表明GmWRKY12提高了擬南芥的耐鹽性。NaCl處理3個轉GbWRKY32基因煙草種子和本生煙草種子，前者種子萌發率、全苗長、根系、干重、鮮重均明顯高于后者，證明GbWRKY32基因可以提高煙草對鹽脅迫的抵御能力[49]。

2.4 其他非生物脅迫

營養元素是植物生長的物質基礎，既可以作為植物體組成成分，又可以調節植物生理功能，直接參與并且協調作物的新陳代謝以及各種生理循環，因此在很大程度上限制著作物的產量以及品質[50]。磷是植物體內核酸、磷脂和ATP的重要組成部分,參與植物體內能量代謝、酶促反應、糖分代謝、光合作用等生理生化反應[51]。因此，植物對磷素的吸收能力成為其生長發育的關鍵制約因素。柱花草StWRKY45基因在受低磷脅迫誘導時表現出高表達，推測StWRKY45基因可能參與柱花草對低磷脅迫的響應[52]。曾銘等[53]用qRT-PCR試驗證明杉木在低磷脅迫下，ClWRKY8、ClWRKY21、ClWRKY24、ClWRKY35的表達量上調，表明這4個基因可能參與調控杉木對鹽脅迫耐受力。

絲瓜在采后儲藏和鮮切后,由于細胞呼吸作用產生過多的自由基而導致膜脂過氧化，從而使其細胞膜產生破裂，酚類物質、酶和氧氣三者發生接觸并導致組織褐變,影響其感官品質和商業價值。劉建汀等[54]研究絲瓜鮮切后WRKY基因表達量變化發現，0～6 h內絲瓜的4個WRKY基因表達量變化趨勢均呈上調趨勢，6 h后表達下調，但趨勢總體上調。

3 問題與展望

種種研究表明，WRKY轉錄因子在調控植物抗逆性方面發揮著巨大的作用。在非生物脅迫下，植物WRKY類轉錄因子通過與目標DNA結合，與相關蛋白互作，參與調控信號網絡，形成了多樣且復雜的網狀調控系統。已報道的WRKY轉錄因子主要著眼于一個轉錄因子功能的研究，或與另一個蛋白之間的互作關系，對WRKY轉錄因子在調控網絡中串擾機制尚未有整體把握。此外，內外部刺激信號如何逐步傳遞給WRKY蛋白，WRKY家族成員間互作如何影響植物各種生理生化反應，WRKY轉錄因子核心序列的變異是否影響目的基因功能的改變等還不完全清楚，因此還需要進一步深入探究和完善。

隨著生物信息學、基因組和轉錄組學、蛋白組學的發展，越來越多植物WRKY轉錄因子家族的神秘面紗被揭開。模式植物和一些植物基因組測序的完成為研究WRKY基因的表達和功能提供了條件，基因工程技術為作物遺傳改良提供新的途徑，也提高了培育植株抗逆新品種的效率。