連作對不同抗性芝麻根系分泌物中酚酸類物質含量的影響及其化感作用

呂豐娟,肖運萍,汪瑞清,魏林根,袁展汽,林洪鑫

(江西省農業科學院 土壤肥料與資源環境研究所/農業農村部 長江中下游作物生理生態與耕作重點實驗室/國家紅壤改良工程技術研究中心,江西 南昌 330200)

芝麻是我國的主要食用油料作物之一,種植面積居世界第4,總產量居世界第1。芝麻籽粒營養豐富,用途廣泛,富含不飽和脂肪酸、蛋白質、維生素E及人體所必需的9種氨基酸。但是,芝麻是對連作障礙敏感的作物。連作導致芝麻田土壤中速效氮、磷、鉀,交換性鈣、鎂,以及有效錳、硼、鐵、銅、鋅含量下降,從而導致土壤供肥能力降低[1]。隨著連作年限的增加,芝麻根際土壤中細菌和放線菌數量減少,真菌數量上升[1,2];在根區土壤中細菌、放線菌和真菌數量均顯著降低,連作3年,分別下降66.1%、76.2%、56.0%,最終導致土壤微生物菌群改變、比例失調[1]。與正茬相比,連作芝麻根際土壤中青枯勞爾氏菌和尖孢鐮刀菌數量升高,而有益菌群芽孢桿菌數量降低[2]。連作3年芝麻青枯病的病情指數由2.54%升高到44.75%,莖點枯病的病情指數由6.80%升高到51.63%[3]。由于以上原因,連作對芝麻產量的影響極其嚴重。連作1～3年,芝麻的單株蒴數下降8.41%～20.85%,單蒴粒數下降7.32%～18.16%,千粒重下降4.69%～14.72%,單株產量下降11.86%～44.07%[1],芝麻單產降低14.0%～64.4%[3]。連作障礙已經成為制約芝麻產業發展的一大重要因素。連作障礙由多種因素所致,大體可概括為:土壤理化性質惡化、土傳病害以及自毒作用三個方面[1-5]。目前,已有關于連作對芝麻產量[6,7]、病害發生[6-8]和土壤理化性質[6]等方面影響的研究報道,但鮮見有連作芝麻自毒物質和自毒作用的研究報道。

化感作用是指植物或者微生物向環境中釋放某些化學物質而有利或者不利于其他有機體生長發育的現象[9]。當受體和供體屬同種或同科植物時產生抑制的現象,即為植物的自毒作用。根系分泌物的自毒作用可能是導致連作地土壤衰退的原因之一[10],而酚酸類物質被公認為根系分泌物中最主要的化感物質,對連作植物造成不利影響[11-13]。前人已經從多種植物的根系分泌物中提取到化感物質,可對同茬或下茬同種或同科植物產生抑制作用。結果表明,不同植物、同一植物不同品種,甚至同種植物在不同生境、不同生育期,其根系分泌物中化感物質的種類和含量均有顯著差異[14-20]。那么,芝麻根系分泌物中的酚酸類物質有哪些？其在不同連作抗性芝麻品種間有何差異？其對芝麻本身有無自毒作用？均鮮見報道。鑒于此,本研究利用盆栽試驗,選取3個不同連作抗性的芝麻品種,收集在正茬和連作條件下芝麻花期的根系分泌物,利用高效液相色譜法(HPLC)對芝麻根系分泌物中的酚酸類物質的含量進行測定,以探討連作對不同芝麻品種根系分泌物中化感物質組成和含量的影響,并從自毒效應方面探明芝麻連作障礙的可能機理。

1 材料和方法

1.1 根系分泌物的收集

盆栽試驗在江西省農業科學院園藝所進行,設置正茬和連作兩種試驗處理。正茬和連作處理所用土壤均為紅壤,取自江西省農業科學院東鄉試驗基地,正茬處理所用土壤近5年內未種植過芝麻,連作處理所用土壤為去年種植過芝麻的土壤。供試品種為贛芝9號、金黃麻和玉山黑芝麻。其中,金黃麻為耐連作品種,玉山黑芝麻為中等耐連作品種,贛芝9號為不耐連作品種[21]。試驗于2016年7月2日播種,每個處理播種6盆,每盆留苗3株。

試驗于芝麻花期(2016年8月17日)對正茬和連作處理的芝麻進行根系分泌物收集,盡量保證根系不受傷害。先抖落掉大土塊,之后用清水沖洗根系上附著的泥土,洗凈后再用去離子水沖洗3遍,進行水培試驗,并用氣泵向營養液中通氣,每2天更換一次營養液,1周后停止水培。所用營養液為霍格蘭和阿農通用營養液(Hoagl and Amon),配方為:硝酸鈣(945 mg/L)、硫酸鉀(607 mg/L)、磷酸二氫銨(115 mg/L)、硫酸鎂(493 mg/L)。收集到的營養液經裝有20 mL XAD-4樹脂的樹脂柱進行根系分泌物收集,再用200 mL甲醇洗脫樹脂中的根系分泌物,將洗脫液于55 ℃減壓蒸發出甲醇后,加入2 mL超純水溶解干燥后的根系分泌物,于-20 ℃保存,作為待測液,供酚酸類物質檢測用,每個處理3次重復。

1.2 酚酸類物質含量的檢測

采用高效液相色譜法(賽默飛世爾的HPLC U3000高效液相色譜系統)對根系分泌物中的酚酸類物質含量進行測定,色譜柱為4.6 mm×250 mm C18柱。精密吸取1 mL樣品,用超純水定容至5 mL,經0.22 μm微孔濾膜過濾進樣,進樣量為20 μL。其中,檸檬酸單標:流動相為甲醇∶水(含0.5%H3PO4)=2∶98,柱溫30 ℃,流速0.6 mL/min,檢測波長220 nm。對羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸混標:流動相為甲醇∶水(含0.5%H3PO4)=15∶85,柱溫30 ℃,流速1 mL/min,檢測波長254 nm。香豆酸、阿魏酸、苯甲酸、水楊酸、苯丙酸、肉桂酸混標:流動相為甲醇∶水(含0.5%H3PO4)=35∶65,柱溫30 ℃,流速1 mL/min,檢測波長254 nm。對樣品采用標準品色譜保留時間進行定性,以峰面積進行定量計算分析。

1.3 酚酸類物質自毒作用的生物檢測

選取均勻一致的芝麻種子,放于鋪有兩層濾紙的培養皿中,每皿60粒,每個處理3次重復。根據3個芝麻品種花期根系分泌物中檢測到的酚酸的種類和含量,設置12種酚酸類化感物質的自毒作用檢測(以無菌水為對照),每種酚酸3個濃度梯度,處理詳見表1,每個處理3次重復。向培養皿中分別加入不同濃度的測定液5 mL,于25 ℃恒溫培養箱中暗培養7 d,期間于培養第3天再次相應加入以上測定液各5 mL,其他時間適當補充蒸餾水,保持濾紙濕潤。測定種子發芽率、胚芽和胚根的長度以及芝麻幼苗鮮重,并計算化感作用效應指數(RI)。

表1 酚酸類物質及其相應濃度梯度

1.4 數據分析與統計

化感作用效應指數(response index, RI)的計算方法參照Williamson[22]:RI=1-C/T(T≥C)或RI=T/C-1 (T0時,表示促進作用;當RI<0時,表示抑制作用;RI的絕對值大小代表化感作用強度。綜合化感指數(synthetical effect, SE)為測試指標的RI平均值。

采用SPSS statistics 20軟件利用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行同一品種不同處理間酚酸類物質含量及其自毒作用生物檢測結果的差異顯著性檢驗(LSD法)和新復極差分析(Duncan法),顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 連作對芝麻根系分泌物中酚酸類物質含量的影響

由表2看出,在正茬條件下,贛芝9號根系分泌物中含量較高的酚酸類物質依次是水楊酸、苯丙酸、檸檬酸、對羥基苯甲酸、苯甲酸和香豆酸;金黃麻根系分泌物中含量較高的酚酸依次是水楊酸、檸檬酸、苯甲酸和對羥基苯甲酸;玉山黑芝麻根系分泌物中含量較高的酚酸依次是水楊酸、對羥基苯甲酸、檸檬酸和香豆酸。由此可見,3個芝麻品種根系分泌物中含量均較高的酚酸為水楊酸、檸檬酸和對羥基苯甲酸。

連作導致芝麻根系分泌物中酚酸種類和含量有所變化,具體表現為:連作條件下贛芝9號根系分泌物中新檢測到香草酸;連作導致贛芝9號根系分泌物中丁香酸、苯甲酸、香豆酸和檸檬酸含量顯著升高,依次升高694.83%、347.58%、289.04%、178.80%;而咖啡酸、對羥基苯甲酸、綠原酸和水楊酸含量顯著降低,依次降低90.23%、73.90%、57.99%、35.68%;其他酚酸含量變化不明顯。在連作條件下金黃麻和玉山黑芝麻根系分泌物中均新檢測到丁香酸和苯丙酸,且苯丙酸含量急劇升高。連作導致金黃麻根系分泌物中香豆酸、苯甲酸、檸檬酸、香草酸、綠原酸、對羥基苯甲酸和水楊酸含量顯著升高,依次升高694.92%、314.08%、270.26%、130.00%、111.49%、47.05%和35.30%;連作對其他酚酸含量無顯著影響。連作導致玉山黑芝麻根系分泌物中綠原酸、水楊酸、苯甲酸和阿魏酸含量顯著升高,依次升高201.16%、168.76%、98.53%和39.50%;檸檬酸和肉桂酸含量分別降低46.92%、62.92%,對其他酚酸含量影響較小。

綜合分析酚酸類物質在3個芝麻品種根系分泌物中的含量及其在正茬和連作處理間的變化,初步認為檸檬酸、苯甲酸、香豆酸和丁香酸可能是導致贛芝9號連作障礙的化感物質;苯丙酸、苯甲酸、檸檬酸、水楊酸、香豆酸、丁香酸和對羥基苯甲酸可能是導致金黃麻連作障礙的化感物質;水楊酸、苯丙酸、丁香酸和苯甲酸可能是導致玉山黑芝麻連作障礙的化感物質。

表2 連作對芝麻根系分泌物中酚酸類物質含量的影響μg/g

注：N表示未檢測到；表中同一品種同一列數據后不同小寫字母表示在0.05水平上的差異顯著性。

2.2 酚酸類物質自毒作用的生物檢測

根據3個芝麻品種根系分泌物中檢測到的酚酸的種類和含量,設置12種酚酸類物質的自毒作用生物檢測(表1)。結合2.1得出的初步結果,本文僅展現可能導致各個芝麻品種連作障礙的化感物質的相關結果(表3～表5)。

2.2.1 贛芝9號的生物檢測 整體而言,與CK相比,表3中4種酚酸類物質對贛芝9號發芽率無顯著影響,對鮮重和芽長有顯著影響(P<0.05),對根長影響達到極顯著水平(P<0.01)。與CK相比,苯甲酸在低濃度時(B1)僅對鮮重有促進作用,對發芽率、芽長和根長無顯著影響；在中濃度時(B2)對4個發芽指標均無顯著影響；高濃度苯甲酸(B3)導致贛芝9號芽長和根長顯著降低,對鮮重和發芽率影響不顯著。香豆酸在低濃度時(Co1)對發芽率、芽長和根長無顯著影響,但對鮮重有促進作用；在中濃度時(Co2)顯著降低根長,但對發芽率、鮮重和芽長無顯著影響；在高濃度時(Co3)可顯著降低贛芝9號的鮮重、芽長和根長。檸檬酸在低濃度時(Ci1)對發芽指標無顯著影響；在中濃度時(Ci2)會顯著降低鮮重和根長,但對發芽率和芽長影響不顯著；在高濃度時(Ci3)導致鮮重、芽長和根長均顯著降低。丁香酸僅在高濃度(Sy3)時顯著降低贛芝9號的發芽率、鮮重和芽長,但對根長影響不顯著。結合以上3種酚酸類物質在贛芝9號根系分泌物中檢測到的濃度(表2),苯甲酸僅在高濃度(B3)時對贛芝9號的發芽指標有影響,而此濃度顯著高于檢測到的濃度,認為苯甲酸不是直接導致贛芝9號連作障礙的化感物質;香豆酸和檸檬酸在中濃度時已經對贛芝9號的發芽有顯著抑制作用,丁香酸在高濃度時也顯著抑制贛芝9號的發芽,且3個物質的濃度均接近贛芝9號在連作條件下根系分泌物中的濃度,因此認為香豆酸、檸檬酸和丁香酸是導致贛芝9號連作障礙的化感物質。

表3 酚酸類物質對贛芝9號種子發芽的影響

注：B、Co、Ci和Sy分別代表苯甲酸、香豆酸、檸檬酸和丁香酸;后綴1、2、3分別表示酚酸的3個濃度梯度。表中同一列數據后不同小寫字母表示差異顯著性達到了0.05水平，下同。

2.2.2 金黃麻的生物檢測 由表4可以看出,與CK相比,苯甲酸在低濃度時(P1)顯著降低金黃麻的發芽率,對其他指標無影響；在中濃度(P2)和高濃度(P3)時顯著抑制金黃麻的發芽率、鮮重和芽長,但對根長無顯著影響。檸檬酸在低濃度(Ci1)和中濃度(Ci2)時對發芽指標無影響,在高濃度時(Ci3)可顯著抑制金黃麻苗的鮮重、芽長和根長。水楊酸在低濃度時(Sa1)導致金黃麻的芽長和鮮重降低,對發芽率和根長無顯著影響；在中濃度時(Sa2)導致發芽率、鮮重和根長降低,對芽長無顯著影響；在高濃度時(Sa3)可顯著抑制4個發芽指標。香豆酸在低濃度時(Co1)對金黃麻的發芽指標無影響；在中濃度(Co2)時顯著降低金黃麻苗的鮮重和根長；在高濃度時(Co3)對4個發芽指標均有顯著抑制作用。丁香酸在低濃度時(Sy1)對金黃麻的發芽指標無影響；在中濃度(Sy2)時可顯著降低鮮重、芽長和根長；在高濃度則對4個發芽指標均有顯著抑制作用。對羥基苯甲酸在低濃度(H1)和中濃度(H2)時對金黃麻發芽指標無影響,但高濃度(H3)可顯著抑制其4個發芽指標。結合上述酚酸物質在金黃麻根系分泌物中檢測到的濃度(表2),檸檬酸和對羥基苯甲酸僅在高濃度時對金黃麻的發芽產生抑制作用,香豆酸雖然在中濃度時就已經對金黃麻的發芽有抑制作用,但這3種酚酸此時的濃度均超出了其在根系分泌物中檢測到的濃度,故認為檸檬酸、對羥基苯甲酸和香豆酸不是直接導致金黃麻連作障礙的化感物質;而苯丙酸、苯甲酸、水楊酸和丁香酸在檢測到的濃度范圍內(低濃度或中濃度時)均對金黃麻的一個或幾個發芽指標產生抑制作用,因此認為苯丙酸、苯甲酸、水楊酸和丁香酸是導致金黃麻連作障礙的化感物質。

表4 酚酸類物質對金黃麻種子發芽的影響

注：P、B、Ci、Sa、Co、Sy和H分別代表苯丙酸、苯甲酸、檸檬酸、水楊酸、香豆酸、丁香酸和對羥基苯甲酸;后綴1、2、3分別表示酚酸的3個濃度梯度。

2.2.3 玉山黑芝麻的生物檢測 與CK相比,水楊酸和苯丙酸的3個濃度梯度均顯著降低了玉山黑芝麻苗的鮮重,但對其他指標無影響。丁香酸在低濃度時(Sy1)對玉山黑芝麻的發芽指標無顯著影響；中濃度(Sy2)和高濃度(Sy3)均導致鮮重、芽長和根長顯著降低,但對發芽率無影響。苯甲酸在低濃度時(B1)對芽長和根長有促進作用；在高濃度時(B3)顯著抑制鮮重和芽長；但在中濃度時(B2)對發芽指標無顯著影響(表5)。結合這4種酚酸物質在玉山黑芝麻根系分泌物中檢測到的濃度(表2),苯甲酸在低濃度和中濃度時對玉山黑芝麻的發芽無抑制作用,認為其不是直接導致玉山黑芝麻連作障礙的化感物質;而水楊酸、苯丙酸和丁香酸在檢測濃度范圍內均對玉山黑芝麻發芽的1個或幾個指標有顯著抑制作用,因此認為這3種物質是導致玉山黑芝麻連作障礙的化感物質。

表5 酚酸類物質對玉山黑芝麻種子發芽的影響

注：Sa、P、Sy和B分別代表水楊酸、苯丙酸、丁香酸和苯甲酸;后綴1、2、3分別表示酚酸的3個濃度梯度。

3 結論與討論

植物根系一個最為顯著的特點是不斷地向根際土壤中分泌各種不同種類的代謝產物,即根系分泌物。根系分泌物主要包括低分子量的有機化合物(糖類、氨基酸類、酚酸類及其他次級代謝產物)、高分子量黏膠質以及細胞脫落物和裂解物[23]。其中,酚酸類物質被公認為根系分泌物中最主要的化感物質,可對連作作物產生不利影響[11-13]。本文首次分析了12種酚酸在芝麻花期根系分泌物中的含量,發現在正茬條件下,水楊酸、檸檬酸和對羥基苯甲酸在3個黑芝麻品種的根系分泌物中含量均較高；除上述3種酚酸類物質外,贛芝9號、金黃麻和玉山黑芝麻根系分泌物中含量較高的其他酚酸類物質分別是苯丙酸、苯甲酸和香豆酸。結果表明芝麻品種不同,其根系分泌物的組分和含量不同,這與前人在其他作物上的研究結論[20,24]一致。

連作會導致土壤理化環境和生物學環境發生變化:土壤酸化、養分失衡、微生物區系失衡、土壤由細菌型向真菌型轉變[2-5],而土壤環境的變化反過來會影響植物的生長發育,從而可能進一步改變植物根系分泌物的組分和含量。本文通過分析3個不同連作抗性芝麻品種在正茬和連作條件下根系分泌物中酚酸類物質組成的變化,發現在連作條件下,贛芝9號根系分泌物中新檢測出香草酸;金黃麻和玉山黑芝麻根系分泌物中均新檢測到丁香酸和苯丙酸。這與劉蘋等[20]對花生的研究結論不同，他們發現連作抗性較強的花生品種的根系分泌物成分變化不大,含量變化較大;連作抗性較差花生品種根系分泌物的組分和含量均有變化。在本研究中,不同連作抗性的3個芝麻品種的根系分泌物組分均發生了變化,且耐連作品種金黃麻和中等耐連作品種玉山黑芝麻表現一致,在連作條件下新檢測出2種酚酸物質,而不耐連作品種贛芝9號僅新檢測出1種酚酸。此外,其他酚酸類物質在3個芝麻品種根系分泌物中的含量變化也顯著不同:贛芝9號根系分泌物中有4種酚酸類物質含量升高,4種物質含量下降;玉山黑芝麻根系分泌物中有4種酚酸類物質含量升高,2種下降;而金黃麻則表現為7種酚酸類物質含量上升,其余無顯著變化。由此可見,芝麻根系分泌物中酚酸類物質組分和含量的變化與連作抗性沒有明顯關系。造成結果差異的原因,一方面與作物不同有關,另一方面與根系分泌物組分的檢測有關:本文僅對12種常見的酚酸類物質進行了檢測,而劉蘋等的檢測成分雖然不多,但未局限于酚酸。導致作物連作障礙的因素很多,作物的連作抗性是一個復雜的問題,因此不同芝麻品種對連作障礙的抗性差異仍需從其他方面進行深入研究。

對化感物質進行自毒作用的生物檢驗是判斷該化感物質是否具有生物毒性的主要方法,而通過計算化感物質在作物苗期對部分生理指標的化感效應指數是目前分析的常規方法[19,22,28]。本文根據各個酚酸類物質在3個不同芝麻品種的根系分泌物中所檢測出的濃度,進行了不同濃度酚酸對芝麻種子發芽影響的試驗,發現絕大多數酚酸對芝麻發芽表現出“低促高抑”現象,結合它們在正茬和連作條件下芝麻根系分泌物中的含量變化,本研究最終認為香豆酸、檸檬酸和丁香酸是導致贛芝9號連作障礙的化感物質,苯丙酸、苯甲酸、水楊酸和丁香酸是導致金黃麻連作障礙的化感物質,水楊酸、苯丙酸和丁香酸是導致玉山黑芝麻連作障礙的化感物質。但是,目前對于根系分泌物的化感作用是否是造成作物連作障礙的主要原因仍存爭議:有人認為別人研究中所用的根系分泌物的濃度過高[5],且分泌到土壤中的根系分泌物可被快速降解[5,25],難以累積到其能發揮化感作用的閾值[26,27],因此化感作用不太可能是導致作物連作障礙的主要原因。本文雖然沒有檢測上述酚酸類物質在連作土壤中的累積含量,但是前人已經證實隨著連作年限的延長,土壤中酚酸類物質含量呈上升趨勢[20,28],且本文是在根系分泌物可檢測到的濃度范圍內對芝麻種子發芽有抑制作用的酚酸才具有生物毒性這一前提下,推斷出哪些酚酸是導致芝麻連作障礙的化感物質。因此,本文關于不同連作抗性芝麻化感物質的結論是可靠的,可以為芝麻連作障礙機理提供理論支撐。不過,本文僅對12種酚酸類物質進行了初步研究,根系分泌物中的其他物質是否也對芝麻產生自毒作用,仍有待進一步研究。

本文通過分析不同連作抗性芝麻根系分泌物中酚酸類物質含量在正茬和連作處理間的變化及其自毒作用,初步得出了3個芝麻品種根系分泌物中存在的化感物質,為芝麻連作障礙機理研究提供了一定的科學依據。但是,根系分泌物除了通過化感作用抑制植物生長直接導致連作障礙外,還可通過改變植物根際和根區土壤的理化性質、微生物組成及土壤酶活性等間接影響植物的生長[25,29-30],土壤環境的變化反過來會進一步影響植物根系分泌物的分泌,如此惡性循環加劇作物連作障礙的發生。因此,芝麻根系分泌物中其他物質(包括本文中沒有化感作用的其他酚酸物質)與土壤環境間如何相互影響,其與不同芝麻品種間的連作抗性又有何關系亦需深入研究。