馮了性風濕跌打藥酒的HPLC指紋圖譜建立及其中10種有效成分的含量測定

胡靜 楊媛媛 崔小敏 任慧 雷琨 陳志永

摘 要 目的：建立馮了性風濕跌打藥酒的高效液相（HPLC）指紋圖譜，并測定其中10種有效成分的含量。方法：采用HPLC 法。色譜柱為Inertsil ODS-3 C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為210 nm（10～15 min，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿）、300 nm（70～120 min，桂皮醛）、345 nm（15～70 min，新綠原酸、東莨菪苷、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內酯、異綠原酸A、異綠原酸C），進樣量為10 μL。以東莨菪內酯峰為參照，繪制10批樣品的HPLC指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》進行相似度評價，確定共有峰。結果：10批樣品共有18個共有峰，相似度均大于0.980，共指認出鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、新綠原酸、東莨菪苷、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內酯、異綠原酸B、柚皮苷、異綠原酸A、異綠原酸C、桂皮醛等12個成分。鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、新綠原酸、東莨菪苷、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內酯、異綠原酸A、異綠原酸C、桂皮醛等10個成分檢測質量濃度的線性范圍分別為2.475～247.5、2.600～260.0、3.820～382.0、3.900～390.0、3.060～306.0、4.760～476.0、4.540～454.0、4.900～490.0、4.540～454.0、7.590～759.0 μg/mL（r 均大于 0.999 0）;定量限分別為0.320 0、0.350 0、0.021 4、0.024 3、0.036 8、0.025 7、0.152 1、0.042 9、0.025 1、0.350 3 μg/mL，檢測限分別為0.160 0、0.180 0、0.007 9、0.004 0、0.001 2、0.007 3、0.076 0、0.001 4、0.008 1、0.201 4 μg/mL;精密度、重復性、穩定性試驗的RSD均小于2%;加樣回收率為95.03%～106.85%（RSD為0.67%～2.68%，n=6）;上述10種成分的含量分別為0.013 3～0.214 1 mg/mL。結論：所建指紋圖譜穩定、準確、專屬性強，可用于馮了性風濕跌打藥酒的質量控制;含量測定方法簡便快速、準確可靠，可用于同時測定其中10種有效成分的含量。

關鍵詞 馮了性風濕跌打藥酒;高效液相色譜法;指紋圖譜;含量測定

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish an HPLC fingerprint for Fengliaoxing fengshi dieda wine， and to determine the contents of 10 effective constituents. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Inertsil ODS-3 C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile -0.1% phosphoric acid water （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 25 ℃， and detection wavelength was set at 210 nm（10-15 min， hydrochloride ephedrine， hydrochloride pseudoephedrine）， 300 nm（70-120 min， cinnamaldehyde）， 345 nm（15-70 min， neochlorogenic acid， scopolin， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid， scopoletin， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C）. The sample size was 10 μL. Using scopoletin peak as reference， HPLC fingerprints of 10 batches of samples were drawn. The similarity evaluation was performed by using Similarity Evaluation System of? TCM Chromatographic Fingerprint （2012 edition） to confirm common peak. RESULTS： There were 18 common peaks in HPLC chromatograms of 10 batches of samples， and the similarity was above 0.980. Totally 12 components including hydrochloride ephedrine， hydrochloride pseudoephedrine， neochlorogenic acid， scopolin， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid， scopoletin， isochlorogenic acid B， narigin， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C and cinnamaldehyde widentified. The linear range of hydrochloride ephedrine， hydrochloride pseudoephedrine， neochlorogenic acid， scopolin， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid， scopoletin， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C and cinnamaldehyde were 2.475-247.5， 2.600-260.0， 3.820-382.0， 3.900-390.0， 3.060-306.0， 4.760-476.0， 4.540-454.0， 4.900-490.0， 4.540-454.0， 7.590-759.0 μg/mL （r>0.999 0）. The limits of quantitation were 0.320 0， 0.350 0， 0.021 4， 0.024 3， 0.036 8， 0.025 7， 0.152 1， 0.042 9， 0.025 1， 0.350 3 μg/mL， respectively;the limits of detection were 0.160 0， 0.180 0， 0.007 9， 0.004 0， 0.001 2， 0.007 3， 0.076 0， 0.001 4， 0.008 1， 0.201 4 μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2%. The? recoveries were 95.03%-106.85% （RSD were 0.67%-2.68%，n=6）.The contents were 0.013 3- 0.214 1 mg/mL. CONCLUSIONS： Established fingerprint is stable， accurate and specific， and can be used for quality control of Fengliaoxing fengshi dieda wine; the content determination method is rapid， accurate and reliable， and can be used for simultaneous determination of 10 components.

KEYWORDS? ?Fengliaoxing fengshi dieda wine; HPLC; Fingerprints; Content determination

馮了性風濕跌打藥酒收載于2015年版《中國藥典》（一部），該藥由丁公藤、麻黃、桂枝等27味中藥組成[1]。方中丁公藤祛風濕為主藥，配以桂枝、麻黃、羌活、蠶沙、白芷發散風寒、祛風濕、舒筋絡，香附、木香、厚樸、枳殼、陳皮、蒼術、苦杏仁、豬牙皂行氣燥濕化痰，小茴香、當歸、川芎、乳香、沒藥、五靈脂、牡丹皮溫經活血祛瘀，白術、山藥、補骨脂、黃精、菟絲子、澤瀉補肝腎、強腰膝，臨床主要用于治療風寒濕痹（風濕、類風濕）、瘀滯腫痛、跌打損傷諸癥，療效確切[2-3]。目前，2015年版《中國藥典》（一部）關于該藥的質量標準中未有含量測定和指紋圖譜測定項[1]，且現有相關文獻報道中未有綠原酸類和異綠原酸類等有效成分的檢測[4-6]。雖然關紅暉等[7]建立了馮了性風濕跌打藥酒的高效液相（HPLC）指紋圖譜，但存在特征峰數量少、指紋特征不明顯等不足。由于馮了性風濕跌打藥酒的藥效成分較多，因此以單一成分或者單一藥材所含的有效成分作為定量測定指標，不能全面控制其內在質量，也無法體現整體質量。

中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段[8-10]，是國際公認的控制中藥或天然藥材質量的方法[11-12]，能夠體現中藥質量控制的整體性[13-14]。基于此，本研究在前期研究的基礎上，建立了馮了性風濕跌打藥酒的HPLC指紋圖譜，并測定了其中10種有效成分的含量，旨在為其整體質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括G7114A紫外檢測器、G7129A自動進樣器、G7111A四元泵、OpenLAB? CDS色譜工作站（美國Agilent公司）;KQ-100型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）;BS210S型、Max210g型萬分之一電子分析天平，BT25S、Max21g型十萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

馮了性風濕跌打藥酒[國藥集團馮了性（佛山）藥業有限公司，批準文號：國藥準字Z44022914，批號：170908、171106、171215、180521、180710、180823、180917、190104、190113、190325，規格：500 mL/瓶;依次編號為S1～S10];鹽酸麻黃堿對照品（批號：171241-201809，純度：≥98%）、鹽酸偽麻黃堿對照品（批號：171237-201510，純度：≥98%）均購自中國食品藥品檢定研究院;柚皮苷對照品（批號：wkq19012809，純度：≥98%）、桂皮醛對照品（批號：wkq19031207，純度：≥98%）均購自四川維克奇生物有限公司;東莨菪苷對照品（批號：16040805）、東莨菪內酯對照品（批號：161208）、綠原酸對照品（批號：1701904）、隱綠原酸對照品（批號：17061401）、新綠原酸對照品（批號：17062003）、異綠原酸A對照品（批號：18090301）、異綠原酸B對照品（批號：17121201）、異綠原酸C對照品（批號：18070401）均購自上海圻明生物科技有限公司（純度均不低于98%）;乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-3 C18（150 mm ×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，5%A;15～15.01 min，5%A→10%A;15.01～40 min，10%A→15%A;40～70 min，15%A→25%A;70～90 min，25%A→40%A;90～110 min，40%A→70%A;110～120 min，70%A）;檢測波長：210 nm（10～15 min，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿）、300 nm（70～120 min，桂皮醛）、345 nm（15～70 min，新綠原酸、東莨菪苷、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內酯、異綠原酸A、異綠原酸C、柚皮苷、異綠原酸B）;流速：1.0 mL/min;柱溫：25 ℃，進樣量：10 μL。

2.1.2 混合對照品溶液Ⅰ的制備 精密稱取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、新綠原酸、東莨菪苷、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內酯、異綠原酸B、柚皮苷、異綠原酸A、異綠原酸C、桂皮醛對照品各適量，置于25 mL量瓶中，加甲醇制成上述12種成分質量濃度分別為0.247 5、0.260 0、0.382 0、0.390 0、0.306 0、0.476 0、0.454 0、0.463 0、0.389 5、0.490 0、0.450 0、0.759 0 mg/mL的混合對照品Ⅰ溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密量取樣品10 mL，置于20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 精密度試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（編號：S1）適量，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，以東莨菪內酯峰的保留時間和峰面積為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，18個共有峰相對保留時間的RSD為0.29%～1.68%（n=6），相對峰面積的RSD為0.22%～1.27%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（編號：S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以東莨菪內酯峰的保留時間和峰面積為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，18個共有峰相對保留時間的RSD為0.69%～1.31%（n=6），相對峰面積的RSD為0.51%～1.83%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.1.6 重復性試驗 取樣品（編號：S1）約10 mL，共6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以東莨菪內酯峰的保留時間和峰面積為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，18個共有峰相對保留時間的RSD為0.19%～0.81%（n=6），相對峰面積的RSD為0.41%～1.59%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.1.7 HPLC指紋圖譜的建立 取10批樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按 “2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》，以S4樣品（隨機選取）色譜圖作為對照色譜，設定時間窗為0～120 min，時間寬度為0.3 min，經多點校正后自動匹配，采用平均值法生成HPLC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.1.8 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》對10批樣品進行相似度分析。結果，10批樣品的相似度均大于0.980，提示不同批次樣品的相似度較高，生產工藝相對穩定，結果見表1。

2.1.9 共有峰的指認 10批樣品共有18個共有峰，通過與混合對照品溶液Ⅰ（圖3）的保留時間比對，指認了12個共有峰，分別為鹽酸麻黃堿（1號峰）、鹽酸偽麻黃堿（2號峰）、新綠原酸（3號峰）、東莨菪苷（4號峰）、綠原酸（5號峰）、隱綠原酸（6號峰）、東莨菪內酯（8號峰）、異綠原酸B（11號峰）、柚皮苷（12號峰）、異綠原酸A（13號峰）、異綠原酸C（15號峰）、桂皮醛（18號峰）。其中，東莨菪內酯峰（8號峰）峰形好、與相鄰色譜峰的分離度好、色譜響應值較高，其對照品價廉易得且保留時間居中，故選擇東莨菪內酯峰（8號峰）為參照，計算其他共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表2、表3。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 同“2.1.1”項。

2.2.2 混合對照品溶液Ⅱ的制備 按“2.1.2”項下方法制備鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、新綠原酸、東莨菪苷、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內酯、異綠原酸A、異綠原酸C、桂皮醛質量濃度分別為0.247 5、0.260 0、0.382 0、0.390 0、0.306 0、0.476 0、0.454 0、0.490 0、0.454 0、0.759 0 mg/mL的混合對照品溶液Ⅱ。

2.2.3 供試品溶液的制備 同“2.1.3”項。

2.2.4 空白對照溶液的制備 精密量取40%乙醇10 mL，置于20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.5 系統適用性試驗 取上述混合對照品溶液Ⅱ、供試品溶液（編號：S1）、空白對照溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果，各待測峰與相鄰峰間的分離度均大于1.5，理論板數不低于10 000，詳見圖4。

2.2.6 線性關系考察 精密量取“2.2.2”項下混合對照品溶液Ⅱ0.1、0.5、1、5、10 mL，分別用甲醇定容至10 mL量瓶中，得系列濃度工作溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，結果見表4。

2.2.7 定量限與檢測限考察 取“2.2.2”項下混合對照品溶液Ⅱ，用甲醇逐級稀釋，按 “2.2.1”項下色譜條件進樣測定，分別以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1計算定量限、檢測限。結果，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、新綠原酸、東莨菪苷、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內酯、異綠原酸A、異綠原酸C、桂皮醛的定量限分別為0.320 0、0.350 0、0.021 4、0.024 3、0.036 8、0.025 7、0.152 1、0.042 9、0.025 1、0.350 3 μg/mL，檢測限分別為0.160 0、0.180 0、0.007 9、0.004 0、0.001 2、0.007 3、0.076 0、0.001 4、0.008 1、0.201 4 μg/mL。

2.2.8 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液Ⅱ適量，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、新綠原酸、東莨菪苷、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內酯、異綠原酸A、異綠原酸C、桂皮醛峰面積的RSD分別為0.45%、0.64%、0.91%、0.31%、1.01%、1.14%、0.66%、0.80%、1.11%、0.81%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.9 穩定性試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液（編號：S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、新綠原酸、東莨菪苷、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內酯、異綠原酸A、異綠原酸C、桂皮醛峰面積的RSD分別為1.76%、0.73%、0.87%、0.49%、0.34%、0.95%、1.23%、1.08%、0.68%、0.71%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.10 重復性試驗 精密稱取樣品（編號：S1）10 mL，共6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量。結果，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、新綠原酸、東莨菪苷、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內酯、異綠原酸A、異綠原酸C、桂皮醛含量的RSD分別為1.57%、0.42%、0.87%、0.89%、1.45%、1.09%、0.56%、0.63%、0.99%、1.83%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.2.11 加樣回收率試驗 精密量取樣品（編號：S1）5 mL，置于20 mL量瓶中，共6份，加入一定量的“2.2.1”項下混合對照品溶液Ⅱ，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果，10種待測成分的加樣回收率范圍為95.03%～106.85%（RSD為0.67%～2.68%，n=6），結果見表5。

2.2.12 樣品含量測定 取10批樣品各10 mL，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品中各成分的含量。各樣品平行操作3次，結果見表6。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

本研究采用紫外檢測器在200～400 nm波長范圍內進行掃描，比較各待測成分在不同波長下的色譜圖。結果發現，各待測成分的最大吸收波長有顯著差異，大部分成分的最大吸收波長在345 nm附近，且分離度較好，響應值較高;雖然在300 nm波長處時色譜峰信息最豐富，但各峰整體響應較345 nm低，吸收不均勻，卻可指認桂皮醛色譜峰，故選擇300 nm波長檢測桂皮醛;鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿在210 nm波長處有最大吸收且在其他波長處的紫外吸收急劇下降，為保證共有峰數目多、分離度好、靈敏度高、干擾少，故選擇于210 nm波長處檢測鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿，于300 nm波長處檢測桂皮醛，于345 nm波長處檢測其余成分。

3.2 參照峰的選擇

由于鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的末端吸收干擾大，綠原酸類、異綠原酸類成分及桂皮醛易分解，故選擇對照品價廉易得、性質穩定、與其他峰分離度較好且藥理作用明確的東莨菪內酯作為參照峰。

3.3 指標性成分的選取

本課題組在前期研究中發現，丁公藤中含有大量的綠原酸類、異綠原酸類和香豆素類成分，尤其是異綠原酸類成分中的異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C等含量較高[15]，且具有抗炎[16]、抗氧化[17]等藥理活性，這些藥理活性與丁公藤具有的抗風濕作用有關。有研究證實，麻黃中生物堿類成分具有發汗和解熱作用，與桂枝配伍可增強其發汗解肌的功效[18-19]。故選擇丁公藤、麻黃和桂枝中的藥效成分作為質量控制的指標性成分具有可行性（由于柚皮苷、異綠原酸B的分離度較差，均小于1.5，故未選擇其作為定量分析的指標性成分）。

3.4 指紋圖譜分析

馮了性風濕跌打藥酒的HPLC指紋圖譜中共有18個共有峰，本研究指認了其中12個成分，分別為鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、新綠原酸、東莨菪苷、綠原酸、隱綠原酸、東莨菪內酯、異綠原酸B、柚皮苷、異綠原酸A、異綠原酸C及桂皮醛。10批馮了性風濕跌打藥酒樣品相似度較好，均大于0.980，提示馮了性風濕跌打藥酒的原料質量和制備工藝較穩定，不同批次樣品中指標性成分的一致性較好。

3.5 含量測定結果分析

本研究結果顯示，鹽酸麻黃堿等10種有效成分為不同批次馮了性風濕跌打藥酒的共有成分，但各批樣品間含量存在較大差異，特別是綠原酸和異綠原酸C的含量相差約0.01 mg/mL。因此，建議將這10種有效成分含量納入樣品的質量標準，可提高其整體質量。

綜上所述，本研究所建指紋圖譜穩定、準確、專屬性強，可用于馮了性風濕跌打藥酒的質量控制;所建含量測定方法簡便快速、準確可靠，可用于同時測定該藥中10種有效成分的含量。

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（收稿日期：2019-09-24 修回日期：2020-03-16）

（編輯：陳 宏）