藏藥四味姜黃湯中10種有效成分含量測定及其煎煮工藝優化

王小艷 向宇楠 高潔 潘琳 畢若紅 賴先榮 李啟恩 李先加

摘 要 目的：建立同時測定藏藥四味姜黃湯中10種有效成分的含量，并對其煎煮工藝進行優化。方法：采用高效液相色譜法測定含量。以浸泡時間、加水量、煎煮時間、煎煮次數為考察因素，10種成分的含量及出膏率的綜合得分為響應值，在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken響應面法優化其煎煮工藝。結果：沒食子酸、柯里拉京、木蘭花堿、鞣花酸、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素進樣量的線性范圍分別為0.280 6～1.683 6、0.289 6～1.737 6 、0.320 8～1.924 8、0.116 0～0.696 0、0.018 9～0.113 5、0.013 3～0.079 9、0.092 3～0.553 8、0.025 5～0.153 0、0.036 1～0.216 3、0.041 0～0.245 7 ?g（r均為0.999 9）;定量限分別為0.28、14.48、3.21、11.60、1.89、4.44、0.46、0.26、0.36、0.41 ng，檢測限分別為0.11、4.14、1.24、3.32、0.58、1.33、0.13、0.09、0.14、0.12 ng;精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均小于3%;加樣回收率為92.56%～103.69%（RSD為0.90%～3.81%，n=6）。該方的最優煎煮工藝為浸泡60 min，加入8倍量（mL/g）水，煎煮2次，每次65 min。6次驗證試驗中，綜合得分為3.323 2～3.422 4分，與預測值（3.437 4）相對誤差的絕對值均小于2%。結論：所建含量測定方法操作簡單，重復性較好，可用于同時測定四味姜黃湯中10種有效成分的含量;優化所得煎煮工藝穩定、可行。

關鍵詞 藏藥;四味姜黃湯;煎煮工藝優化;高效液相色譜法;Box-Behnken響應面法;含量測定

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of 10 kinds of active components in Tibetan medicine Siwei jianghuang prescription， and to optimize its decoction technology. METHODS： HPLC method was adopted. Using soaking time， the amount of added water， decoction time and decoction times as factors， comprehensive score of the contents of 10 kinds of components and solid extracts rate as response values， one the basis of single factor test， Box-Behnken response surface method was used to optimize its decoction technology. RESULTS： The linear range of gallic acid， corilagin， magnoflorine， ellagic acid， hydrochloric jatrorrhizine， hydrochloride palmatine， hydrochloride berberine， bisdemethoxycurcumin， demethoxycurcumin and curcumin were 0.280 6-1.683 6， 0.289 6-1.737 6， 0.320 8-1.924 8， 0.116 0-0.696 0， 0.018 9-0.113 5， 0.013 3-0.079 9， 0.092 3-0.553 8， 0.025 5-0.153 0， 0.036 1-0.216 3， 0.041 0-0.245 7 ?g （all r were 0.999 9）， respectively. The limits of quantitation were 0.28， 14.48， 3.21， 11.60， 1.89， 4.44， 0.46， 0.26， 0.36， 0.41 ng， respectively. The limits of detection were 0.11， 4.14， 1.24， 3.32， 0.58， 1.33， 0.13， 0.09， 0.14， 0.12 ng， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 3%. The recoveries were 92.56%-103.69% （RSDs were 0.90%-3.81%， n=6）. The optimal decoction technology included soaking 60 min， adding 8-fold （mL/g） water， decoction for twice， lasting for 65 min each time. In 6 validation tests， comprehensive scores were 3.323 2-3.422 4， and the absolute value of the relative error with the predicted value （3.437 4） was less than 2%.CONCLUSIONS： Established method is simple and repeatable， and can be used for simultaneous determination of 10 kinds of active components in Siwei jianghuang prescription. Optimized decoction technology is stable and feasible.

KEYWORDS? ?Tibetan medicine; Siwei jianghuang prescription; Decoction technology optimization; HPLC; Box-Behnken response surface method; Content determination

標準湯劑即以中醫藥理論為指導、臨床應用為基礎，參考現代提取方法，經標準化工藝制備而成的中藥水煎劑，可用于表征中藥湯劑的一般狀態[1]。藏藥四味姜黃湯為藏醫經典，《藍琉璃》[2]中記載其由姜黃、小檗皮、余甘子、蒺藜等濃煎，內服，可用于治療尿頻癥，是藏醫藥治療“京尼薩庫病”即糖尿病及其并發癥的傳統方劑[3]。藏藥四味姜黃湯含有生物堿類、多酚類、姜黃素類、蒺藜皂苷類等有效成分[4-5]，具有抗氧化、改善血糖等作用[6-10]。由于藏醫經典文獻中并未記載其具體的制備方法，為此本研究前期按照《古代經典名方中藥復方制劑簡化注冊審批管理規定》[11]中經典名方物質基準及經典名方制劑的要求，同時參考《醫療機構中藥煎藥室管理規范》[12]制備了藏藥四味姜黃湯，并以方中生物堿類成分木蘭花堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿，多酚類成分沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸，姜黃素類成分雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素等為指標，建立了測定上述成分含量的高效液相色譜法（HPLC）;通過Box-Behnken響應面法對其煎煮工藝進行優化，以得到符合臨床用藥要求的液體制劑，并為藏藥四味姜黃湯的新藥研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括G1311B型四元泵、內置真空脫氣機、G1329B型標準自動進樣器、G1315D型二極管陣列檢測器、G1316A型柱溫箱、Chemstation色譜工作站（美國Agilent公司）;UPH-I-10T型優普純水制造系統（成都超純科技有限公司）;DZKW-4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）;CPA225D型十萬分之一、BSA124S型萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司];RE-2000A型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

沒食子酸對照品（批號：DST180226-008，純度：≥99%）、柯里拉京對照品（批號：DST170313-012，純度：≥98%）、鞣花酸對照品（批號：DST170105-004，純度：≥98%）、雙去甲氧基姜黃素對照品（批號：DST171220-21，純度：≥98%）、去甲氧基姜黃素對照品（批號：DST171220-30，純度：≥98%）均購自成都德思特生物技術有限公司;姜黃素對照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-16050404，純度：≥99.59%）;鹽酸小檗堿對照品（批號：Y-035-171216，純度：>98%）、鹽酸巴馬汀對照品（批號：Y-156170227，純度：>98%）、木蘭花堿對照品（批號：M-026170913，純度：>98%）、鹽酸藥根堿對照品（批號：Y-023-171216，純度：>98%）均購自成都瑞芬思生物科技有限公司;乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為飲用水（煎煮用）或純化水（色譜分析用）。

姜黃飲片（批號：180601231）、蒺藜飲片（批號：190100791）均購自成都康美藥業有限公司;余甘子飲片（批號：20180704）購自成都荷花池藥材市場;小檗皮飲片（批號：20190609001）購自青海省西寧市藥材市場，均經成都中醫藥大學藥學院賴先榮教授鑒定，分別為姜科植物姜黃（Curcuma longa L.）的干燥根莖、蒺藜科植物蒺藜（Tribulus terrestris L.）的干燥成熟果實、大戟科植物余甘子（Phyllanthus emblica L.）的干燥果實、小檗科植物刺紅珠（Berberis dicryophylla Franch.）的干燥內皮。

2 方法與結果

2.1 四味姜黃湯中10種成分的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Capcell Pak C18-MGⅡ（250 mm×4.6 mm，5 ?m）;流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，3%A;8～15 min，3%A→17%A;15～20 min，17%A;20～33 min，17%A→19%A;33～38 min，19%A→25%A;38～48 min，25%A;48～70 min，25%A→80%A）;流速：1.0 mL/min;進樣量：10 ?L;柱溫：30 ℃;檢測波長：270 nm（0～60 min，沒食子酸、柯里拉京、木蘭花堿、鞣花酸、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿）、420 nm（60～70 min，雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素）[13]。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸、柯里拉京、木蘭花堿、鞣花酸、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素對照品各適量，加甲醇溶解制成含上述各對照品質量濃度分別為1.403、1.448 1、1.604、0.58、0.757、0.666、0.923、0.510、0.721、0.819 mg/mL的單一對照品溶液;取上述各單一對照品溶液適量，加甲醇釋釋，制成上述各對照品質量濃度分別為140.3、144.8、160.4、58、9.462 5、6.66、46.15、12.75、18.025、20.475 ?g/mL的混合對照品溶液，于4 ℃冷藏，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 按處方比例稱取姜黃、小檗皮、余甘子、蒺藜飲片共60 g，加入8倍量（mL/g）水，浸泡60 min后，煎煮2次，每次65 min，趁熱過濾，合并濾液。室溫下取濾液1 mL，98～100 ℃水浴揮干，加甲醇溶解并定容至5 mL量瓶中，搖勻，經0.45 ?m濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 陰性對照溶液 按藏藥四味姜黃湯的處方比例分別稱取各單味藥材飲片，按“2.1.3”項下方法分別制備缺姜黃、小檗皮、余甘子、蒺藜的陰性對照溶液。

2.1.5 空白對照溶液 以甲醇為空白對照溶液。

2.1.6 系統適用性試驗 取上述混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可知，各待測成分基線分離，分離度均大于1.5，其他雜質成分對待測成分無干擾，陰性對照對測定亦無干擾，理論板數以沒食子酸峰計不低于5 000。

2.1.7 線性關系考察 取“2.1.2”項下混合對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件分別進樣2、4、6、8、10、12 ?L，記錄峰面積。以各待測成分進樣量（x，?g）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，結果見表1。

2.1.8 定量限與檢測限考察 取“2.1.2”項下混合對照品溶液，以甲醇倍比稀釋，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計算定量限、檢測限。結果，沒食子酸、柯里拉京、木蘭花堿、鞣花酸、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的定量限分別為0.28、14.48、3.21、11.60、1.89、4.44、0.46、0.26、0.36、0.41 ng，檢測限分別為0.11、4.14、1.24、3.32、0.58、1.33、0.13、0.09、0.14、0.12 ng。

2.1.9 精密度試驗 取“2.1.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定6次，記錄峰面積。結果，沒食子酸、柯里拉京、木蘭花堿、鞣花酸、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素峰面積的RSD分別為1.14%、0.97%、2.10%、1.27%、2.30%、2.97%、2.25%、1.40%、0.95%、0.94%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.10 穩定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液適量，于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，沒食子酸、柯里拉京、木蘭花堿、鞣花酸、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素峰面積的RSD分別為1.11%、1.07%、0.38%、1.70%、0.29%、1.44%、0.75%、3.24%、1.27%、0.54%（n=8），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩定性較好。

2.1.11 重復性試驗 按處方比例精密稱取各藥材飲片每份約60 g，共6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品含量。結果，沒食子酸、柯里拉京、木蘭花堿、鞣花酸、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素含量的RSD分別為1.69%、1.87%、1.22%、2.25%、0.92%、1.97%、1.47%、2.97%、1.46%、1.25%（n=6），表明方法重復性較好。

2.1.12 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的各藥材飲片適量，共6份，加入一定量（加入量按含量的100%計算）的“2.1.2”項下各單一對照品溶液，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果，沒食子酸、柯里拉京、木蘭花堿、鞣花酸、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的加樣回收率分別為96.24%～101.66%（RSD=2.33%，n=6）、92.56%～102.96%（RSD=3.81%，n=6）、98.43%～102.81%（RSD=1.58%，n=6）、96.61%～101.34%（RSD=2.71%，n=6）、98.14%～99.94%（RSD=0.90%，n=6）、97.53%～103.44%（RSD=2.18%，n=6）、97.64%～103.53%（RSD=2.48%，n=6）、99.41%～103.13%（RSD=1.27%，n=6）、100.15%～103.69%（RSD=1.45%，n=6）、99.57%～102.84%（RSD=1.44%，n=6），表明方法準確度較好。

2.1.13 樣品含量測定 按處方比例稱取各藥材飲片共60 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，共3批，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，平行操作3次，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品含量，結果見表2。

2.2 出膏率測定

精密吸取 “2.1.3”項下供試品溶液10 mL，置于干燥至恒定質量的蒸發皿中蒸干，浸膏于105 ℃干燥3 h后移至干燥器中冷卻30 min，迅速稱定質量，計算出膏率。出膏率（%）=浸膏量（g）/原藥材質量（g）×100%。

2.3 單因素試驗

2.3.1 綜合評分 由于綜合評分法要求對選定的指標進行加權，經驗性加權法主要根據選定指標的重要程度來確定權重系數，具有主觀性和片面性[14-15]，因此本研究參考相關文獻[16-17]，同時結合含量測定結果，采用SPSS 21.0統計軟件對數據進行主成分分析和降維-因子分析。結果顯示，沒食子酸、柯里拉京、木蘭花堿、鞣花酸、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素含量及出膏率等11個指標的權重系數分別為0.111 28、0.111 17、0.111 53、0.110 91、0.109 59、0.109 55、0.111 42、0.110 99、0.111 03、0.112 33、 -0.109 80，綜合得分（Y）=X1×0.111 28+X2×0.111 17+X3×0.111 53+X4×0.110 91+X5×0.109 59+X6×0.109 55+X7×0.111 42+X8×0.110 99+X9×0.111 03+X10×0.112 33-X11×0.109 80（X表示對應的指標）。

2.3.2 單因素考察 ①浸泡時間：按處方比例稱取各藥材飲片共60 g，考察不同浸泡時間（30、60、90、120 min）對綜合得分的影響;結果，浸泡90 min時綜合得分最高，為3.294 0分，詳見圖2A。②加水量：按處方比例稱取各藥材飲片共60 g，考察不同加水量（6、8、10、12、14、16倍）對綜合得分的影響，平行測定3次;結果，雖然加入14倍量水時的綜合得分最高，為3.604 4分，但與10倍（3.579 6分）時相當，詳見圖2B。③煎煮次數：按處方比例稱取各藥材飲片共60 g，考察不同煎煮次數（1、2、3、4次）對綜合得分的影響，平行測定3次;結果，雖然煎煮4次時綜合得分最高，為3.569 9分，但與煎煮2次（3.507 3分）相當，詳見圖2C。④煎煮時間：按處方比例稱取各藥材飲片共60 g，考察不同煎煮時間（30、60、90、120、150 min）對綜合得分的影響，平行測定3次;結果，煎煮90 min時綜合得分最高，為3.432 1分，詳見圖2D。考慮到操作的簡便及成本的控制，故后續選擇浸泡時間30、60、90 min，加水量6、8、10倍，煎煮次數1、2、3次，煎煮時間30、60、90 min進行后續試驗。

2.4 Box-Behnken 響應面法優化煎煮工藝

2.4.1 Box-Behnken響應面法試驗設計與結果 在單因素試驗的基礎上，以浸泡時間（A，min）、加水量（B，mL/g）、煎煮時間（C，min）、煎煮次數（D，次）為考察因素，采用Design-Expert 8.0.6軟件，按Box-Behnken響應面法設計原理[18-19]，以11個指標的綜合得分為響應值，進行4因素3水平試驗設計。因素與水平見表3，試驗設計方案與結果見表4（成分1～10分別為按前文順序排列的10個待測成分，單位為mg/g，下同）。

2.4.2 模型分析與預測 采用Design-Expert 8.0.6軟件對表4的試驗數據進行二次多項式回歸擬合，得綜合得分（Y）=3.370-1.435×10-3A+0.047 B+0.051C+0.300D+ 0.012AB+0.014AC+0.051AD-0.020BC-0.085BD-8.684×10-4CD-0.110A2-0.180B2-0.160C2-0.400D2。方差分析結果見表5。

由表5可見，回歸方程中，一次項D、二次項B2、C2、D2顯著（P<0.05），交互項AB、AC、AD、BC、BD、CD均不顯著（P >0.05）;模型的P<0.05，提示該模型可用于11種指標綜合得分的分析和預測，且各影響因素對綜合得分的順序依次為D（煎煮次數）> C（煎煮時間）>B（加水倍數）>A（浸泡時間）。

2.4.3 各因素交互作用分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件繪制各影響因素的響應面圖，詳見圖3。由圖3可知，因素BD、因素AD交互作用較強，因素AB、因素CD交互作用較弱，其交互強弱順序依次為BD>AD>BC>AC>AB>CD。

2.4.4 最優煎煮工藝的確定 采用Design-Expert 8.0.6軟件預測的最優煎煮工藝為浸泡時間62.86 min、加水量8.06倍、煎煮時間64.86 min、煎煮次數2.38次。考慮到實際操作，確定最優煎煮工藝為浸泡時間60 min、加水8倍、煎煮時間65 min、煎煮次數2次。

2.4.5 驗證試驗 按處方比例稱取各藥材飲片共60 g，按“2.4.4”項下最優煎煮工藝條件進行試驗驗證，平行操作3次（結果見表6序號1～3）;同時，根據《醫療機構中藥煎藥室管理規范》[12]與《中藥飲片標準湯劑》（第1卷）[20]對藥液規格和濃縮體積（0.2 g/mL）的規定，按最優煎煮工藝進行驗證（結果見表6序號4～6）。結果顯示，與模型預測值（預測綜合得分3.437 4分）比較，相對誤差的絕對值均小于2%，提示優化后的煎煮工藝穩定、可行。

3 討論

本研究采用HPLC法測定了四味姜黃湯中10種成分的含量，結果顯示，方中沒食子酸、木蘭花堿、鹽酸小檗堿含量較高，姜黃素類成分含量偏低，其原因可能與各成分在水溶液中的溶解度有關。在供試品溶液的制備中，筆者分別比較了酚酸類、生物堿類以及姜黃素類成分在25%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇等中的溶解度，結果顯示各成分相互影響溶出，酚酸類成分在50%甲醇中溶解較好，姜黃素類成分和生物堿成分在甲醇中溶解較好，考慮實際操作，選擇甲醇為溶劑。由于試驗條件欠缺，本研究未對蒺藜藥材中的有效成分進行分析，后續本課題組將進一步探索。

中藥標準湯劑是在中醫藥理論指導下，按照臨床湯劑煎煮流程的規范化操作而煎得[21]。臨床用湯劑的標準化煎藥方法十分重要，應避免銅、鐵、鋁等易與中藥成分發生化學反應的器具[21]。考慮到操作方便，可使用玻璃器皿或不銹鋼容器，本研究采用圓底燒瓶進行回流煎煮;而煎煮用溶劑可選擇符合標準的飲用水，其成本低廉且方便易得。有研究對中藥經典名方的加水量進行了探討，結果發現根據藥材的質地、疏松程度，加水量不同，一般以沒過藥面2～5 cm為宜[22-23]。另有研究發現，煎煮2次，每次20～30 min后中藥中的有效成分可大部分溶出[24-25]。而本方中的藥材多為質地堅硬的滋補類中藥，煎煮時間可比一般藥材適當延長。因此，綜合考慮選擇浸泡時間、加水量、煎煮時間、煎煮次數為指標進行單因素考察。

四味姜黃湯原方為四味姜黃湯散，亦同于煮散，是將中藥飲片粉碎后與水共煎，去渣取汁得到的中藥液體制劑，兼有湯劑和散劑的共同特點[26]。本研究以四味姜黃湯標準湯劑的工藝研究為基礎，采用Box-Behnken響應面法對其煎煮工藝進行優化，得到最優煎煮工藝為浸泡60 min，加入8倍量水，煎煮2次，每次65 min。經驗證，工藝優化后的綜合評分與模型預測值的相對誤差的絕對值均小于2%，表明該工藝穩定、可行。

綜上所述，所建含量測定方法操作簡單、重復性較好，可用于同時測定四味姜黃湯中10種有效成分的含量;優化所得煎煮工藝穩定、可行。

參考文獻

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（收稿日期：2019-10-16 修回日期：2020-03-07）

（編輯：陳 宏）