表面增強拉曼光譜法快速測定娃娃菜中啶蟲脒殘留

藍勇波，江培淳，林長虹，袁福定，古麗君，鄭彥婕*

深圳市計量質量檢測研究院（深圳 518000）

啶蟲脒是一種新型煙堿類殺蟲劑，廣泛用于農產品的害蟲防治，同時也對動物的神經系統和生殖系統具有潛在毒性，對人類健康構成威脅[1-2]。所以，進行蔬菜中啶蟲脒殘留量的測定具有重要意義。目前主要的檢測方法是基于色譜，包括高效液相色譜法[3]、氣相色譜法[4]、液相色譜-質譜聯用法[5]、氣相色譜-質譜聯用法[6]等。這些方法依賴大型儀器，樣品前處理時間長。因此，有必要建立一種簡單、快速、準確的方法，進行啶蟲脒的檢測。表面增強拉曼光譜（Surface-enhanced Raman scattering，SERS）具有儀器便攜、檢測速度快、靈敏度高、能提供分子指紋信息等特點，適合現場快速檢測。現已逐步用于食品中非法添加劑、農獸藥殘留、肉類品質以及保健品中非法添加物等的快速檢測[7-9]。在實際應用中，由于SERS的增強基底納米金和納米銀受樣品基體影響較大，適當的樣品前處理方法可以有效提高SERS定性定量的準確性。覃文霞等[10]建立了一種新型溶劑萃取法提取糕點及白酒中的糖精鈉，并采用稀硝酸作為凝聚劑使納米金與目標物分子緊密結合后檢測，獲得較強的SERS信號。林翔等[11]使用三氯乙酸沉淀牛奶中的蛋白質，同時促進納米銀的聚集，增強信號，簡化試驗步驟，提高檢測的靈敏度。

試驗使用納米金作為SERS增強基底，對娃娃菜樣品前處理條件以及SERS檢測條件進行優化，在優化條件下建立啶蟲脒的定量方法，為娃娃菜中啶蟲脒的快速測定提供試驗依據，也為開發適合SERS檢測的蔬菜前處理方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

娃娃菜，購自深圳市某大型生鮮超市；98.1%啶蟲脒標準品，購自Dr. Ehrenstorfer GmbH；99.0%無水乙酸鈉、純活性炭，均為分析純，購自西隴科學股份有限公司；99.5%氯化鈉，分析純，購自廣州化學試劑廠；98.0%無水硫酸鎂，分析純，購自永華化學科技（江蘇）有限公司；中性氧化鋁（100～200目），購自國藥集團化學試劑有限公司；石墨化碳黑（60～80目），購自天津市光復精細化工研究所；N-丙基乙二胺（PSA），購自天津博納艾杰爾科技有限公司；十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18），購自上海博勢生物科技有限公司；乙腈，色譜純，購自深圳市晶園玻璃儀器有限公司；納米金（OTR202），購自蘇州歐普圖斯光學納米科技有限公司；拉曼測試管，購自賽默飛世爾科技有限公司。

RamTracer-200-cm激光拉曼光譜儀，蘇州歐普圖斯光學納米科技有限公司；JA1203B電子天平，上海越平科學儀器有限公司；IKA VORTEX3振蕩器，艾卡（廣州）儀器設備有限公司（IKA中國）；H1850離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 樣品前處理

稱取2.0 g均質后的娃娃菜樣品于離心管中，向其中加入4 mL乙腈和2.0 g無水硫酸鎂，振動5 min，以4 000 r/min離心5 min，取上清液于含有60 mg PSA和60 mg C18的離心管中，振蕩2 min，以4 000 r/min離心3 min，上清液為待測液。

1.3 SERS檢測

激光光源功率200 mW，激發波長785 nm，積分時間10 s，積分3次，取平均值。將600 μL納米金、20 μL待測液依次加入拉曼測試瓶中，混合2 min后進行光譜檢測。

2 結果與分析

2.1 光譜定性

與未經過前處理的娃娃菜加標提取液SERS譜圖（圖1-b）相比，經過前處理的娃娃菜加標提取液SERS譜圖（圖1-a）出現了多個明顯的啶蟲脒特征峰，且沒有1 520 cm-1處的雜峰。結果說明該樣品前處理方法能有效地去除娃娃菜基質干擾，增強啶蟲脒分子的SERS特征峰信號。

由圖1（a）可以看出，628，827，1 041，1 107和1 493 cm-1處出現特征峰，分別歸屬于C—Cl基團伸縮振動、苯環的呼吸振動、苯環的伸縮振動、N—C＝N基團的伸縮振動以及苯環的伸縮振動[12]。其中628 cm-1處的特征峰信號較強，且附近無干擾信號。因此，選擇628 cm-1處的特征峰作為檢測娃娃菜中啶蟲脒農藥殘留的定性分析峰。

2.2 樣品前處理條件優化

2.2.1 萃取鹽的種類及用量

萃取鹽的主要作用是加速目標分子與萃取相的傳質過程，使目標分子萃取進有機層，與水相雜質分離。在SERS檢測中，某些萃取鹽還可以起到調節待測液酸堿性、改變納米金增強基底聚集狀態從而改變SERS信號的作用。固定PSA、C18的用量和SERS檢測條件，考察氯化鈉固體、無水醋酸鈉、無水硫酸鎂不同加入量對SERS信號的影響，結果如圖2所示。當無水硫酸鎂的用量為2.0 g時，加標提取液的SERS信號最強。無水硫酸鎂溶于水，呈弱酸性，提取溶劑乙腈中含有少量水，因此待測液也呈弱酸性。納米金與待測液混合之后發生團聚，SERS信號增強。這是因為納米金粒子表面電磁場顯著增強，粒子間產生強的表面等離激元耦合，導致其中的SERS信號增強[13]。無水硫酸鎂用量過多時，納米金團聚成大顆粒沉淀下來，待測液中起增強作用的納米金數量變少，SERS信號大幅度下降。氯化鈉溶液為中性，對SERS信號增強效果較弱。加入少量無水醋酸鈉時，有增強效果，隨著用量增大，SERS信號隨之減弱。醋酸鈉水溶液為堿性，啶蟲脒在堿性環境下不穩定。因此，根據試驗結果，選擇無水硫酸鎂作為萃取鹽，用量為2.0 g。

圖1 娃娃菜啶蟲脒加標提取液的SERS譜圖

圖2 萃取鹽種類和用量對SERS信號的影響

2.2.2 凈化劑的種類及用量

PSA含有強極性的氨基基團，易與脂肪酸、糖類、醇等分子中的羥基形成共價鍵將其吸附[14]。中性氧化鋁也是一類強極性的吸附填料，通常用于去除芳香族和脂肪族的化合物[15]。固定無水硫酸鎂、C18的用量和SERS檢測條件，考察PSA和中性氧化鋁這兩種強極性凈化劑不同加入量對SERS信號的影響。由圖3（A）可知，當PSA用量為60 mg時，待測液有最強的SERS響應。

C18含有十八烷基，易于吸附非極性或極性小的分子，如脂肪和蠟質等[16]。GCB表面為疏水性，可以吸附非極性和弱極性化合物，如色素和甾醇類[17]。固定無水硫酸鎂、PSA的用量和SERS檢測條件，考察C18和GCB這兩種弱極性凈化劑不同加入量對SERS信號的影響。由圖3（B）可知，當C18用量為60 mg時，待測液有最強的SERS響應。因此，采用60 mg PSA和60 mg C18用于娃娃菜中啶蟲脒的提取。

圖3 凈化劑種類和用量對SERS信號的影響

2.3 SERS檢測條件優化

2.3.1 待測液用量

固定前處理條件、納米金用量、納米金和待測液混合時間，考察待測液用量對SERS信號的影響。如圖4所示，SERS信號隨著待測液用量的增加，呈現先增加后減小的趨勢，當用量為20 μL時，有最強的SERS信號。當待測液用量小于20 μL時，SERS信號低。這可能是啶蟲脒分子數目較少，SERS信號較弱。當待測液用量大于20 μL時，因為鹽溶液過多導致納米金形成沉淀，待測液中納米金數目減少，導致SERS信號強度減小[18]。因此，選擇20 μL作為SERS檢測時最優的待測液用量。

2.3.2 納米金用量

固定前處理條件、待測液用量、納米金和待測液混合時間，考察納米金用量對SERS信號的影響。從圖5可以看出，啶蟲脒加標提取液在628 cm-1處的信號強度隨納米金用量的增加，呈現先增加后減小的趨勢。當納米金加入量為600 μL時，有最強的SERS響應。納米金用量過小，部分待測物分子沒有被增強；用量過大，納米金稀釋待測物的作用大于增強作用，SERS信號降低。因此，選擇600 μL作為SERS檢測時最優的納米金用量。

圖4 待測液用量對SERS信號的影響

圖5 納米金用量對SERS信號的影響

2.3.3 待測液與納米金混合時間

納米金溶膠與待測液混合后的聚集狀態會隨著時間變化，導致SERS相應的變化。固定前處理條件、待測液用量、納米金用量，考察納米金和待測液混合不同時間后SERS信號的變化。如圖6所示，SERS信號強度隨混合時間的增加，呈現先增加后減小的趨勢。當混合120 s后，有最強的SERS響應。這是因為混合時間的長短影響待測液中啶蟲脒分子在納米金表面的吸附量和兩者的聚集程度，進而影響到SERS特征峰強度[19]。因此，將納米金溶膠和待測液混合120 s后進行SERS檢測。

圖6 混合時間對SERS信號的影響

2.4 娃娃菜中啶蟲脒的定量分析

在優化條件下以628 cm-1處特征峰峰面積（Y）對應娃娃菜提取液濃度（X，mg/kg）繪制標準曲線，結果如圖7所示。該方法在1.0～60 mg/kg濃度范圍內具有良好的線性關系，方法的工作曲線為Y=759.15X+ 11 095（R2=0.991 1），能檢出的最低濃度為0.5 mg/kg。方法的靈敏度滿足GB 2763—2016《食品國家安全標準食品中農藥最大殘留限量》白菜類中啶蟲脒限量的檢測要求（1 mg/kg）。

應用優化的前處理方法、SERS檢測條件和工作曲線，對啶蟲脒加標濃度為1，2和5 mg/kg的娃娃菜進行回收率試驗，結果如表1所示。加標回收率的范圍為81.0%～110.0%，相對標準偏差RSD為3.3%～8.5%（n=6）。結果表明所建立的方法準確度和精密度可靠，可滿足白菜類中啶蟲脒的快速檢測要求。

圖7 不同濃度加標的SERS譜圖（A）和標準曲線（B）

表1 娃娃菜樣品加標回收試驗結果

3 結論

試驗建立了一種娃娃菜中啶蟲脒農藥殘留的表面增強拉曼光譜分析法。通過試驗，優化了前處理條件和SERS檢測條件。在最佳檢測條件下，啶蟲脒的濃度與628 cm-1處的拉曼特征峰面積在1.0～60 mg/kg范圍內具有良好的線性關系，最低檢測濃度可達0.5 mg/kg，回收率范圍為81.0%～110.0%，相對標準偏差在3.3%～8.5%之間。該方法具有操作簡便、快速準確等優點，適用于娃娃菜中啶蟲脒的快速檢測，同時為開發適合SERS檢測的蔬菜前處理方法和檢測方法提供參考依據。