中華綠螂抗氧化肽的提取及其抗氧化性

李翠芬，呂建秋，孔美蘭

華南農業大學食品學院（廣州 510642）

作為對生命體特殊生理功能的營養物質，活性肽對機體生命活動具有重要的作用，由于其可被人體腸道直接吸收，比氨基酸更易進入血液，成為20世紀90年代后期的開發熱點[1]。在生物活性肽和功能性食品的研究中，通常會將生物活性肽作為食品及保健品原料或添加原料，其用途廣、前景佳、市場潛力大。抗氧化活性肽從屬于生物活性肽[2]。生物體內的具有抗氧化活性的物質許多都屬于蛋白質類，蛋白質優良的乳化特性，使其能在油水界面起橋梁作用，在清除過量自由基和抑制膜脂質過氧化方面具有重要的研究意義[3]。隨著生物學的迅猛發展，發現由于結構特點，介于蛋白質和氨基酸間的肽類與氨基酸、大分子蛋白質等其他生物分子相比，其食用安全性、活性、多樣性更加突出。其抗氧化性比蛋白質和氨基酸更為顯著[4]。

抗氧化肽是熱門的研究方向，抗氧化肽對于抑制、延緩脂質氧化，保護人體組織器官免受自由基侵害有特定作用[4]。食物蛋白通過水解作用得到的抗氧化肽具有天然性、高安全性、強抗氧化性和易吸收性等特點[4-5]。抗氧化肽的作用機理是直接作用在自由基，或者間接消耗掉容易生成自由基的物質，防止發生氧化反應進一步發生[5]。

中華綠螂是一種低脂肪高蛋白食品，是粵東地區盛產的水產品，可作為制取抗氧化肽的優質原料。由于中華綠螂加工技術水平和回收手段落后，造成大量水溶性蛋白流失，且對廢水處理帶來新的難題[6]。試驗以中華綠螂作為原料，利用響應面法和超濾法，對中華綠螂中抗氧化肽的木瓜蛋白酶水解提取工藝條件進行優化，以減少廢水處理的負擔，并將沒有開發利用的蛋白資源轉化，成為高附加值的健康物質。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

1.1.1 材料

中華綠螂（2016年7月購于潮州市楓春市場，所用部位為去殼后的肉，經熱風干燥和粉粹過篩后密封冷凍保存）。

1.1.2 試劑

木瓜蛋白酶（國藥集團化學試劑有限公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，分析純，美國Sigma公司）；95%乙醇（分析純，東莞市正源化工有限公司）；鹽酸（分析純，佛山市偉豐貿易有限公司）；氫氧化鈉（分析純，德州市富凱化工有限責任公司）。

1.2 儀器與設備

電子天平（BSA124S，賽多利斯科學儀器有限公司）；酸度計（PB-10，賽多利斯科學儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（HWS-24，上海一恒科學儀器有限公司）；高速臺式離心機（H1650，長沙湘儀離心機儀器有限公司）；可見分光光度計（WFJ7200，尤尼柯儀器有限公司）；數控超聲波清洗器（KQ-500DV，昆山市超聲儀器有限公司）；切向流超濾系統（BIOQ-MV1000，匯和堂生物工程設備有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

原料的預處理→中華綠螂懸浮液→調值→設計不同溫度、pH、加酶量和水解時間的試驗進行酶解→95℃，滅酶→離心→上清液為含抗氧化肽的可溶性蛋白水解液→測定自由基清除率

最優工藝條件下→重復上述步驟制備含抗氧化肽的可溶性蛋白水解液→超濾純化→測定自由基清除率→確定最佳超濾膜孔徑

1.3.2 試驗步驟

1.3.2.1 原料預處理

將中華綠螂浸泡吐沙、沖洗、熱燙、去殼取肉、65℃下烘干、高速粉碎、50目過篩，得到中華綠螂粉即為試驗原料，真空包裝并冷凍儲藏備用。

1.3.2.2 制備含抗氧化肽的可溶性蛋白水解液

準確稱取1.00 g干燥的中華綠螂粉，置于燒杯中，加入30 mL新鮮制備的蒸餾水，攪拌使其形成懸濁液，用1 mol/L的NaOH溶液或1 mol/L的HCl溶液調節pH至酸度計顯示出所需值為止，待恒溫水浴鍋升至所需溫度，一邊攪拌一邊往燒杯加入一定量木瓜蛋白酶，用保鮮膜封住杯口避免水分的揮發，把燒杯放置進去，到達所需時間即反應完畢，將燒杯拿出并置于95℃水浴中滅酶10 min，滅酶結束后用流水沖淋杯壁使之冷卻至常溫，離心（4 000 r/min、15 min）取上清液，即得不同濃度水解液[7]。

1.3.2.3 酶解物DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基常用來研究酚類抗氧化劑構效關系，是一種合成的有機自由基。DPPH乙醇溶液呈紫色，在波長517 nm處有一強吸收，但是自由基清除劑與其單電子配對而使其吸收減弱，其褪色程度與接受的電子數呈定量關系，因而可用分光光度計法進行定量分析。

稱取0.025 6 g DPPH試劑，用乙醇50%溶解，定容轉入100 mL容量瓶中，將DPPH儲備液搖勻，質量濃度為0.025 6 g/100 mL，置于冰箱冷凍備用，在使用之前將50%乙醇稀釋成質量濃度0.002 5 g/100 mL。將DPPH溶液在正常室溫的情況下放置10 min后，在反應容器中加入2 mL 0.002 5 g/100 mL的DPPH乙醇溶液，加入2 mL不同濃度的中華綠螂肉蛋白質水解液，混合搖勻，在正常的室溫情況下避光反應30 min，將50%乙醇歸零，測定波長517 nm處吸光度（A0）。測定2 mL DPPH溶液與2 mL 50%乙醇溶液在波長517 nm處吸光度（Ai），測定2 mL樣品待測液與2 mL 50%乙醇溶液在波長517 nm處吸光度（Aj）。在同一條件下重復3次，計算求出自由基清除率，取平均值[8]。

2 結果與討論

2.1 響應面法優化中華綠螂抗氧化肽提取工藝

2.1.1 單因素試驗指標

分別在固定的酶與底物濃度比值（[E]/[S]）、酶解溫度、酶解pH和酶解時間條件下，考察酶與底物濃度的比值（[E]/[S]）、酶解溫度、酶解pH和酶解時間對中華綠螂含抗氧化肽的可溶性蛋白的自由基清除率的影響。

根據單因素條件試驗，初步選定酶與底物濃度比值（[E]/[S]）5%、酶解溫度55℃、酶解pH 5.0和酶解時間2.5 h為最佳提取條件，采用響應面法對酶解提取中華綠螂中抗氧化肽的工藝條件進行優化[9]。

2.1.2 響應面分析

在單因素試驗結果基礎上，以酶解時間（A）、酶解溫度（B）、酶與底物濃度的比值（C）和酶解pH（D）作為影響因素[9]，以DPPH自由基清除率（R）作為響應值，根據Box-Beknhen中心組合試驗設計原理，設計四因素三水平響應面試驗。試驗進行29次，每個試驗點重復做3次，結果取3次數據的平均值。采用隨機化原則以減少隨機誤差。試驗安排及結果見表1和表2。

表1 中華綠螂抗氧化肽提取響應面試驗設計因素水平

表2 中華綠螂抗氧化肽提取工藝優化響應面法試驗設計及結果

2.1.3 模型的建立及其顯著性檢驗

試驗用酶解法處理中華綠螂以提取抗氧化肽，以自由基清除率為指標，采用響應面分析法優化最佳工藝條件，利用Design-Expert軟件對表2數據進行二次多項式模型和多元線性模型擬合，得到最佳的數學模型。

從方差分析及相關系數考察模型可靠性。由表3可知，模型F=2.57＞F0.05(14,14)=2.48，p＜0.05，證明試驗所用二次多項模型具有顯著性。在總的作用因素下，B項的影響顯著，而方程的交互項p＞0.05，表明其對中華綠螂抗氧化肽提取的影響不顯著，各具體因子對響應值的影響不是簡單的線性關系，各因子間交互作用影響不顯著，可忽略。失擬項F=1.86，在α=0.05水平上不顯著，說明該模型能很好地描述試驗結果，可用該模型來分析和預測中華綠螂提取抗氧化肽的工藝結果[9]。

2.1.4 提取工藝的響應曲面分析與純化

為更直觀地表現2個因素對中華綠螂抗氧化肽含量的影響，可以令其他因素水平值為零，即是以酶與底物濃度的比值（[E]/[S]）、酶解溫度、酶解pH和酶解時間4個因素中1個因素取零水平時，另3個因素對中華綠螂抗氧化肽自由基清除率得影響進行分析。圖1～圖6反映各因素交互作用對響應值的影響。

結果顯示，B（酶解溫度）對中華綠螂提取抗氧化肽的效果影響最為顯著，表現為曲線較陡，隨著A（酶解時間）、C（酶與底物濃度比值）、D（酶解pH）增加或減小，響應值變化較大；A（酶解時間）、C（酶與底物濃度比值）、D（酶解pH）對響應值影響較小，曲線較為平滑，其數值的增加或者減小，對響應值變化都較小[9]。

表3 回歸方程各項的方差分析表

圖1 酶解時間與酶解溫度的響應曲面關系圖

圖2 酶解時間與酶用量的響應曲面關系圖

圖3 酶解時間與pH的響應關系圖

圖4 酶解溫度與酶用量的響應關系圖

圖5 酶解溫度與pH的響應關系圖

考慮到實際操作的可行性，將提取抗氧化肽工藝條件修正為酶解時間3 h、酶解溫度46.9℃、酶與底物濃度比值6%、酶解pH 4.11，在此條件下進行3次重復驗證試驗，中華綠螂抗氧化肽自由基清除率為97.93%，與理論值基本吻合，說明采用響應面法優化得到的提取條件參數準確可靠，具有一定實用價值。

表4 中華綠螂抗氧化肽自由基清除率最優值及其最大得率的預測值表

2.2 超濾法純化對其抗氧化性的影響

固定操作壓力、操作溫度及料液質量濃度等工藝參數來考察5個不同截留相對質量的超濾膜對可溶性蛋白酶解物的初步分離純化效果[10]。

由表5可見，截留相對質量3 000～1 000 Da的超濾膜對于中華綠螂抗氧化肽自由基清除率的效果最好，為94.96%，說明抗氧化肽的相對分子量在3 000～1 000 Da，有利于抗氧化肽與大分子物質、溶劑的分離，有分離時間短，不發生相變，以及成本低等優點，且易于實現工業化生產。

表5 不同截留相對質量的超濾膜對中華綠螂抗氧化肽自由基清除率影響表

3 結論

圖6 酶用量和pH的響應關系圖

2.1.5 提取工藝的優化與驗證

用Design Expert軟件對試驗參數進一步優化，可以得到最優條件：A（酶解時間）3.09 h（實際應用采用3 h）、B（酶解溫度）46.9℃、C（酶與底物濃度比值）6%、D（酶解pH）4.11。此時中華綠螂抗氧化肽自由基清除率可達98.89%，可得到方程R1= 84.47-0.32A-9.68B+7.92AB-11.5B2。

木瓜蛋白酶水解中華綠螂制備抗氧化肽的最優工藝條件為：底物濃度6%、pH 4.11、酶解溫度40℃、酶解時間3.09 h、超濾膜截留分子質量3 000～1 000 Da。在此條件下，中華綠螂抗氧化肽對DPPH自由基清除率為97.64%，超濾所得可溶性蛋白酶解物的抗氧化性為94.96%，所得回歸模型顯著（p＜0.05），與理論預測值基本吻合。由此看來，中華綠螂蛋白酶解物中存在清除自由基的活性肽，表現出較好抗氧化能力，為中華綠螂制取天然抗氧化肽提供理論依據。

4 展望

隨著生活水平的提高，人們逐漸認識到人的衰老和許多疾病與體內物質氧化產生的自由基密切相關[10]。在人體新陳代謝過程中會不斷產生各種自由基，并作為難以分解的代謝物殘留在人體內。自由基是指含有一個或多個未配對電子的分子、原子、基團或離子，化學性質活潑，反應性極強，容易反應生成穩定分子[11]。

因此，把抗氧化肽作為抗氧化劑應用到食品、化妝品和醫療保健品等行業中，抗氧化肽可以做到營養、天然、安全、無毒、健康、保健的要求。

抗氧化劑被廣泛應用于化妝品、食物，生產量最大的是化學抗氧化劑，但受到毒性作用的限制。由于水解反應制備的抗氧化肽毒性小，更天然，更安全，因此往往比化學合成抗氧化肽更受到青睞[12]。抗氧化性是近年來國內外學者對多肽生物活性研究中的一個熱點，來源于食物蛋白的抗氧化肽，不但抗氧化性優良且安全性高，因而在保健食品及生物醫藥領域的應用前景十分可觀[12]。

中華綠螂可溶性蛋白回收利用制備抗氧化肽可對廢水處理發揮作用，減少資源浪費，也為抗氧化的制備在水產領域開拓思路。