高效液相色譜法檢測辣條中喹諾酮類藥物的方法

唐黎瓊，馬媛媛，彭英，趙波，邱會東*

1. 通標標準技術服務（上海）有限公司（上海 200233）；

2. 重慶科技學院化學化工學院（重慶 401331）；3. 上海進出口檢驗檢疫局（上海 200135）

辣條作為國內許多青少年、兒童喜歡的零食之一，大多數辣條等麻辣類食品[1-5]因生產環境不衛生，可能會導致拉肚子等腸胃現象，而不法商家為防止此類現象出現，非法向辣條等麻辣食品中添加具有抗菌普廣、副作用小、價格便宜等優點的喹諾酮類抗生素，這類藥物不僅會殘留在食品里，逐漸增加細菌的耐藥性，還會通過食物進入人體，危害人體健康，損害消化系統、神經系統、免疫系統等。然而，休閑食品辣條中喹諾酮類藥物的分析研究在國內還未見相關報道，試驗選取常見的氧氟沙星、諾氟沙星和環丙沙星3種喹諾酮類藥物作為分析對象，建立一種液相色譜法檢測辣條中喹諾酮類藥物的分析方法，為國家相關職能監督管理部門更有效開展該類食品安全監控，并對國家監管部門制定相應檢驗方法標準提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（LC-20AD，日本島津公司）；高速離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；旋渦混合器（美國Henry Troemner公司）；超聲波提取儀（上海寧商超聲儀器有限公司）；氮吹儀（上海安譜實驗科技有限公司）。

甲醇、乙腈、乙酸和三乙胺（均為色譜純試劑）；EDTA、檸檬酸、磷酸氫二鈉、氨水、正己烷、乙酸乙酯（均為分析純試劑）；氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星（均為標準品，源葉生物科技有限公司）。

辣條（重慶市售“長壽面”“面筋”“叫花雞”“羊肉串”等4個不同辣條產品）。

1.2 試驗方法

準確稱取2 g辣條試樣于15 mL離心管中，用移液管準確移取10 mL含1%乙酸的乙腈溶液于離心管中，渦旋振蕩1 min，充分混合均勻后，放入超聲提取儀中超聲15 min，高速離心5 min，過濾上層清液。向殘渣中加入5 mL含1%乙酸的乙腈溶液，重復操作，將2次上層清液用0.22 μm尼龍濾膜過濾至刻度試管中，放于40℃氮吹儀中吹至近干，加入2滴甲酸后，用甲醇定容到2 mL，濾液進行高效液相色譜檢測，辣條類食品前處理及分析過程示意圖如圖1所示。

圖1 辣條食品前處理及分析過程示意圖

1.3 儀器測試條件

LC-20A高效液相色譜的色譜條件：島津C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相A為0.1%磷酸水溶液（用三乙胺調pH至2.8），流動相B為甲醇；流速1 mL/min；柱溫為室溫；激發波長351 nm，發射波長465 nm；進樣量10 μL；二元梯度洗脫。

2 結果與討論

2.1 喹諾酮類藥物熒光光譜

利用50 μg/mL喹諾酮類藥物混合標準溶液在波長320～580 nm范圍內進行最大發射波長（EM）的掃描，在波長252～445 nm范圍內進行最大激發波長（EX）的掃描，3種喹諾酮類藥物混合標準溶液的最大激發波長為351 nm，最大發射波長為465 nm，結果如圖2所示。

圖2 喹諾酮類混合標準溶液的激發和發射熒光光譜圖

2.2 液相色譜流動相梯度洗脫條件的優化

根據喹諾酮類藥物性質及相關文獻[6-8]，選取C18色譜柱作為3種喹諾酮類藥物的分離柱，以0.1%磷酸的水溶液（三乙胺調pH 2.8）-甲醇作為流動相進行梯度洗脫，每次進樣量10 μL，流速1 mL/min，通過對比0.1%磷酸水溶液和甲醇不同配比構成的流動相，結合實際樣品中雜質出峰時間在3～8 min，保證3種喹諾酮類藥物出峰的保留時間在10～15 min，以及色譜峰分離度大于1.5，流動相梯度洗脫條件如表1所示，色譜流出曲線如圖3所示。

表1 高效液相色譜流動相梯度洗脫條件

圖3 梯度淋洗喹諾酮類藥物色譜圖

2.3 提取液種類的選擇

辣條主要成分為小麥粉、辣椒、香辛料及防腐劑等，由于其基質及食品添加劑復雜，因此在樣品前處理過程中，提取液的選擇極為重要。根據待測組分的性質及相關文獻[9-12]，準確稱取2 g加標辣條置于15 mL離心管中，按照試驗方法分別加入10 mL含1%乙酸的乙腈溶液、含10%高氯酸的乙腈溶液、乙酸乙酯和EDTA-Mcllaine緩存溶液4種提取液提取辣條中喹諾酮類藥物并進行優化，通過試驗發現乙酸乙酯會提取出較多的油脂，多次脫脂會導致待測組分的損失；含10%高氯酸的乙腈作提取液時，由于高氯酸沸點高，在氮吹儀中無法揮發濃縮，且高氯酸酸性太強，不宜進入色譜柱；1%乙酸的乙腈溶液提取效率明顯高于EDTA-Mcllaine緩存溶液，1%乙酸的乙腈溶液提取液對喹諾酮類藥物提取效率在80%～98%之間，因此選取1%乙酸的乙腈溶液作為試驗提取液。

2.4 提取液用量的選擇

分別準確稱取2 g加標辣條置于15 mL離心管中，按照試驗方法考察分別加入5.0，7.5，10.0和12.5 mL含1%乙酸的乙腈溶液對喹諾酮類藥物提取效率，每組提取劑平行3次試驗，不同提取劑用量對提取效率的影響如圖4所示。

試驗表明隨著提取液用量的增加，喹諾酮類藥物提取效率隨之增加，用量10.0 mL時樣品中喹諾酮類物質基本上被提取出來，因此最佳提取劑用量為10.0 mL。

2.5 超聲提取時間的選擇

為加快提取時間，試驗采用超聲波提取儀提取辣條中喹諾酮類藥物。分別準確稱取2 g加標辣條置于15 mL離心管中，分別考察超聲提取時間5，10，15和20 min，按照試驗方法進行提取試驗，每組提取劑平行3次試驗，不同超聲提取時間對提取效率的影響如圖5所示。

超聲波作用時間越長，界面擴散層上分子擴散越快，喹諾酮類藥物提取率隨著超聲時間增大呈現增加趨勢，超聲15 min提取率達到最大值；但過長的超聲時間使提取溫度升高，有可能導致待提取組分分解損失。因此，確定超聲提取時間15 min。

2.6 提取溫度的選擇

分別準確稱取2 g加標辣條置于15 mL離心管中，按照試驗方法分別考察提取溫度40，50和60℃對喹諾酮類藥物的影響，每組平行3次試驗，不同提取溫度對提取效率的影響如圖6所示。

通過試驗發現，超聲提取溫度50℃時喹諾酮類藥物提取率達到最大，但提取溫度過高，超聲的空化效應可能減弱，提取率反而降低。因此，試驗選擇超聲提取溫度50℃。

圖4 提取液用量對提取率的影響

圖5 超聲提取時間對提取率的影響

圖6 提取溫度對提取率的影響

2.7 標準曲線及方法檢出限和定量限

分別移取3種10 μg/mL的喹諾酮類藥物標準溶液，用甲醇依次稀釋成0.1，0.2，0.5，1.0，2.0和4.0 μg/mL呈倍數增長的混合標準工作溶液，按照液相色譜測試條件繪制喹諾酮類藥物工作曲線，稀釋混合標準溶液接近試劑空白進行方法檢出限試驗，試驗結果如表2所示。

表2 3種喹諾酮類藥物液相色譜分析法相關參數

3 樣品分析

在重慶某小學門口購買某品牌長壽面（樣品A）辣條、某品牌面筋（樣品B）辣條、某品牌叫花雞（樣品C）辣條和某品牌羊肉串辣條（樣品D）4個辣條產品，按照試驗方法提取辣條中喹諾酮類藥物及液相色譜條件分析實際樣品中喹諾酮類藥物，4個辣條產品試驗結果如表3所示。

表3 辣條樣品中喹諾酮類藥物含量 μg/mL

通過試驗發現每個品牌的辣條產品中均含有2種及以上不同喹諾酮類藥物，由于不同類別的產品基質及食品添加劑不同，其基質效應對喹諾酮類藥物的回收率有一定影響。但是，辣條樣品種檢測出喹諾酮類藥物均屬于違規添加行為，對青少年的成長勢必造成潛在健康風險。

4 結論

針對青少年、兒童喜歡的辣條食品，試驗建立一種快速、準確檢測辣條產品中喹諾酮類藥物的液相色譜分析方法，該方法能在短時間內同時檢測不同種類辣條中違規添加的喹諾酮類藥物，為國家職能監管部門制定辣條產品檢測喹諾酮類抗生素藥物提供一定科學技術依據。