油用牡丹籽油的水酶法提取工藝優化

王慧娟，吳正奇，葉文祥，蔣園園，萬端極*

1. 湖北工業大學土木建筑與環境學院（武漢 430068）；2. 湖北工業大學生物工程與食品學院（武漢 430068）

牡丹，古稱木芍藥，屬毛莨科芍藥屬灌木多年生木本植物。牡丹根（丹皮）是重要的中藥材，眾多近代藥理研究表明丹皮具有消炎、提高免疫力、調節心血管系統等作用。同時，牡丹籽富含豐富的油脂和蛋白，自2011年3月22日中華人民共和國國家衛生健康委員會（原中華人民共和國衛生部）批準牡丹籽油為新資源食品起，近年來受到頗多關注。油用牡丹是指牡丹組植物中，籽出油率不低于22%的種的統稱[1]。劉建華等[2]和王昌濤等[3]均采用正己烷提取牡丹籽油后分析其脂肪酸組成，一致表明不飽和脂肪酸含量約達到90%，其主要成分亞麻酸和亞油酸分別超過了56%和28%。且亞麻酸和亞油酸是人體不能合成，只能通過食物獲得的必需脂肪酸。毛程鑫等[4]的研究表明，牡丹籽油中維生素E的含量達到了56 mg/100 g。Sarker等[5]發現牡丹籽中含有芪類和黃酮類。同時，王蕓[6]對牡丹籽油的小鼠急性毒性試驗表明，牡丹籽油屬無毒級食物、無至畸作用。董振興等[7]研究牡丹籽油對高血脂癥大鼠、糖尿病小鼠的影響，發現其具有降低血脂和血糖的作用。截至目前為止，我國油用牡丹種植面積已達到2萬 hm2左右，其適種范圍廣，且林下荒坡均可種植。然而，我國食用植物油約有63%依賴進口[8]，大力發展牡丹籽油，對于緩解這一現狀極具重要意義。

目前牡丹籽油的提取，現已有報道的有壓榨法、溶劑法、超臨界CO2萃取法、水酶法。然而，傳統的壓榨法機械耗能大、餅粕殘油率高，且高溫高壓過程容易產生致癌物苯并芘；溶劑法提油，成品油中會有微量溶劑殘留，于人體和環境都會造成一定危害；超臨界CO2萃取法雖然提油率高、沒有引入有機溶劑，但其設備高昂，工業化的普及受到了極大的限制；已有的水酶法工藝大多采用多酶體系，其游離油提取率較低、酶解離心后形成較厚的乳化層，因而工業化成本高昂。試驗采用水酶法提取牡丹籽油，在酸熱法預處理牡丹籽仁的基礎上，使用單一酶種，旨在探究一種能最大程度減少乳化層厚度、提高游離油提取率且成本經濟的水酶法提取牡丹籽油的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設備

去殼牡丹籽仁（產自山西）；堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶（購于龐博生物工程有限公司）；中性蛋白酶、酸性蛋白酶、高溫淀粉酶、中溫淀粉酶（購于諾維信生物技術有限公司）；其余試劑均為分析純；蒸餾水為實驗室自制。

FW177中草藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）；HH-601電熱恒溫水浴鍋（上海偉業儀器廠）；FA2004分析天平（常州市幸運電子設備有限公司）；數字型pH計（上海方畦儀器有限公司）；101A-1型電熱鼓風干燥箱（南京恒星實驗設備有限公司）；凱氏定氮儀（上海安亭科學儀器廠）；JOYN-SXT-06索式提取器（上海喬越電子科技有限公司）；SX-10-12型箱式電阻爐控制箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；電子萬用爐（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 牡丹籽主要成分的測定

水分的測定：參照GB 5009.3—2010執行。脂肪的測定：參照GB/T 5539—2008執行。蛋白質的測定：參照GB/T 5009.5—2010凱氏定氮法執行。淀粉的測定：參照GB 5009.9—2016執行。灰分的測定：參照GB 5009.4—2016執行。

1.2.2 牡丹籽油的提取工藝及操作要點

將未完全去殼的牡丹籽仁及雜質剔除，剩余完全去殼牡丹籽仁用粉碎機粉碎后過篩（40目），注意粉碎時控制粉碎機溫度不宜過高，避免牡丹籽油氧化。準確稱取過篩后的牡丹籽粉（50 g），與水按一定的料水質量比混合，混合液置于恒溫水浴鍋內，在一定的溫度、pH下攪拌一定的時間。然后，將選定的酶在其最適條件下在混合液中加入一定量的酶（酶/籽，干基計）。反應一定的時間后，立即將混合液在3 500 r/min下離心10 min，得游離油、乳化層、水解液、渣相。取水解液，測水解液中總蛋白質量。小心將游離油和乳化層合并后再次離心，盡可能多地從乳化層分離出游離油，稱重。將經過兩次離心后所得乳化層采用一定的方法破乳，所得破乳油稱重。每組試驗進行3次重復試驗，取其平均值。各項油脂提取率及水解蛋白提取率計算公式如式（1）～（4）所示：

式中：m1為游離油質量，g；M為牡丹籽粉質量，g；w為牡丹籽粉中脂肪的質量分數，%。

式中：m2為破乳所得油脂質量，g。

式中：m3為水解液中的總蛋白質量，g；φ為牡丹籽粉中蛋白質的質量分數，%。

1.2.3 牡丹籽預處理條件的優化

1.2.3.1 料水質量比的優化

參照1.2.2工藝路線，制備5份牡丹籽粉，每份試樣分別調節料水質量比1∶4，1∶5，1∶6，1∶7和1∶8，在預處理pH 4，50℃下反應4 h，酶解離心，計算游離油提取率，以確定最佳料水質量比。

1.2.3.2 預處理pH的優化

參照1.2.2工藝路線，制備5份牡丹籽粉，按最佳料水質量比混合后，每份試樣分別調節pH 2.5，3，3.5，4，5和5.5，在預處理溫度50℃下反應4 h，酶解離心，計算游離油提取率，以確定最佳預處理pH。

1.2.3.3 預處理溫度的優化

參照1.2.2工藝路線，制備5份牡丹籽粉，按最佳料水質量比和預處理pH處理后，每份試樣分別在溫度20，30，40，50和60℃下反應4 h，酶解離心，計算游離油提取率，以確定最佳預處理溫度。

1.2.3.4 預處理時間的優化

參照1.2.2工藝路線，制備5份牡丹籽粉，按最佳料水質量比、預處理pH及溫度處理后，每份試樣分別反應5，6，7，8和9 h，酶解離心，計算游離油提取率，以確定最佳預處理時間。

1.2.3.5 預處理條件的正交試驗

影響牡丹籽游離油的因素主要包括預處理料水質量比（A）、pH（B）、溫度（C）、時間（D），每個因素根據單因素試驗情況，選取三個顯著水平，采用L9(34)正交試驗以游離油提取率為指標，優化牡丹籽預處理的工藝條件。

1.2.4 牡丹籽酶解條件的優化

1.2.4.1 酶種的選擇

參照1.2.2工藝路線，制備6份牡丹籽粉，按最佳預處理條件預處理牡丹籽粉后，每份試樣分別添加堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中溫淀粉酶、高溫淀粉酶，各酶制劑加酶量為2%，酶解4 h后離心，計算游離油提取率，以確定最佳酶制劑。

1.2.4.2 加酶量的優化

參照1.2.2工藝路線，制備5份牡丹籽粉，按最佳預處理條件及酶制劑處理后，每份試樣加酶量分別為1.5%，2%，2.5%，3%和3.5%，酶解4 h后離心，計算游離油及水解蛋白提取率，以確定最佳加酶量。

1.2.4.3 酶解時間的優化

參照1.2.2工藝路線，制備5份牡丹籽粉，按最佳預處理條件、酶制劑及加酶量處理后，每份試樣分別酶解3，4，5，6和7 h后離心，計算游離油及水解蛋白提取率，以確定最佳酶解時間。

1.2.5 破乳方法的優化

參照遲延娜等[9]對花生頑固乳狀液破乳方法，并進行有效調控。

1) 極端pH處理：將乳狀液與適量的水解液混合，調pH分別為1.5，2.5，3.5，10，11和12，室溫下攪拌1 h，以3 500 r/min離心10 min，計算破乳油提取率，取其最大值。

2) 熱處理：在100℃水浴20 min后，以3 500 r/min離心10 min，計算破乳油提取率，取其最大值。

3) 冷凍解凍處理：在-20℃冷凍12 h，90℃水浴解凍15 min后，以3 500 r/min離心10 min，計算破乳油提取率，取其最大值。

4) 乙醇輔助處理：乳狀液與50%的乙醇按1∶1的質量比混合，室溫下攪拌30 min，以3 500 r/min離心10 min，計算破乳油提取率，取其最大值。

2 結果與分析

2.1 脫殼牡丹籽主要成分

由表1可知，牡丹籽富含油脂和蛋白質，其中粗脂肪含量高達34.37%，蛋白質含量接近22%，具有很高的綜合利用價值。然而，牡丹籽較高的蛋白含量也為水酶法提油帶來了困難，因為在水相體系中以蛋白質為主的表面活性劑吸附在油水界面上，極大地限制了油脂的游離，致使較多的油脂被束縛在乳化層[10]。

表1 脫殼牡丹籽主要成分 %

2.2 牡丹籽預處理條件的確定

油料作物細胞壁主要由纖維素、半纖維素等構成，其中少量果膠和木質素填充在纖維素分子形成的網狀結構中。由表1可知，牡丹籽主要成分為油脂、蛋白質及淀粉，而它們中的絕大多數則主要被細胞壁所包裹。Bair等[11]指出油脂體分布在由蛋白質構成的網狀結構中。此外，水酶法提油由于處于水環境下，蛋白質的乳化性限制了油脂的游離，同時溶液中部分淀粉水解為糊精后也會包裹住油脂分子[12]，也限制了油脂游離。因此，在酶解之前，采用合適的方法預處理牡丹籽，使油料細胞內油脂盡可能充分釋放，同時降低油脂被乳化的程度成為水酶法制備牡丹籽油的必要前提。

2.2.1 料水質量比對游離油提取率的影響

料水質量比與游離油提油率的關系見圖1。隨著料水質量比的增加，游離油的提取率逐漸增大，當料水質量比大于1∶7以后，游離油的提取率呈明顯下降趨勢。這是因為料水質量比過小，體系黏度大，不利于油脂的游離；料液比過大，酶的相對濃度小，不利于酶解充分。雖然1∶7的游離油提取率最高，但較1∶6增幅不大，綜合考慮經濟效益，選擇料水質量比1∶6。

圖1 料水質量比對游離油提取率的影響

2.2.2 預處理pH對游離油提取率的影響

預處理pH與游離油提油率的關系見圖2。pH越小，游離油提取率越高，當pH小于3.5以后，游離油提取率逐漸減少。分析原因可能是溶液pH過高，植物細胞組織結構未被充分破壞，導致后續酶制劑與底物接觸不充分，游離油提取率降低。隨著pH降低，植物細胞中果膠、可溶性蛋白質及碳水化合物等物質的溶出，使得油料細胞結構變得松散，為隨后酶制劑與底物的接觸創造了良好的條件[13]，利于油脂的游離。但溶液pH過低，游離脂肪酸增多，使得游離油提取率降低、油品下降。因此，選擇pH 3.5進入下一步優化試驗。

圖2 預處理pH對游離油提取率的影響

2.2.3 預處理溫度對游離油提取率的影響

預處理溫度與游離油提油率的關系見圖3。游離油提取率隨溫度升高呈現先增加后減少的趨勢。分析原因可能是隨著溫度升高，分子熱運動加快，促進了細胞內可溶性固形物的部分溶出，從而增強了后續酶與底物的接觸。但溫度過高，一方面由于牡丹籽原料淀粉含量約占到12%，淀粉發生糊化造成體系黏度增加，束縛了油脂的游離；另一方面，其會促使部分油脂水解為脂肪酸，致使游離油提取率降低。因此，溫度選取40℃進入下一步優化試驗。

圖3 預處理溫度對游離油提取率的影響

2.2.4 預處理時間對游離油提取率的影響

預處理時間與游離油提油率的關系見圖4。隨著時間的延長，游離油提取率在5～7 h之間增加明顯，但超過7 h后提取率增長趨勢不顯著。考慮的生產成本，選取7 h進入下一步工藝優化。

圖4 預處理時間對游離油提取率的影響

2.2.5 牡丹籽預處理條件的正交試驗

正交試驗因素水平見表2，正交試驗設計與結果見表3。極差分析結果表明，影響牡丹籽游離油提取率因素的順序為預處理pH＞溫度＞時間＞料水質量比；水酶法提取牡丹籽油預處理的最優組合為A2B2C2D3，即預處理料水質量比為1∶6、pH為3.5、溫度40℃、時間8 h。在此條件下，游離油提取率為69.65%。

2.3 牡丹籽酶解條件的確定

2.3.1 酶種對游離油提取率的影響

對各酶制劑進行預試驗，所得最適溫度和pH見表4。不同酶種與游離油提油率的關系見圖5。選用四種蛋白酶時游離油提取率均比兩種淀粉酶高，分析原因可能是在水相體系中，牡丹籽較高的蛋白含量及溶液攪拌過程中形成的脂蛋白復合體，對油脂的游離起主要限制作用。其中選用堿性蛋白酶時游離油提取率最高，因此選取堿性蛋白酶為最佳酶種。

表2 因素水平表

表3 正交試驗結果

表4 不同蛋白酶最適溫度和pH

圖5 不同酶種對游離油提取率的影響

2.3.2 加酶量對游離油及水解蛋白提取率的影響

加酶量與游離油及水解蛋白提取率的關系見圖6，隨著加酶量的增加，游離油和水解蛋白提取率不斷增加，但當超過3%以后，游離油與水解蛋白提取率趨于穩定。這一點與Rhee等[14]所發現是是一致的，即油脂的提取率與水解蛋白質的提取率有很好的正相關性。分析原因可能式加酶量太少，蛋白質未被充分酶解，仍有較多蛋白質與油脂構成的復合體，隨著加酶量增多，脂蛋白復合體不斷被分解，大部分油脂基本被萃取出來，繼續增加酶量對游離油提取率沒有多大改變[15]，最終選定加酶量為3%進入下一優化試驗。

圖6 不同加酶量對游離油及水解蛋白提取率的影響

2.3.3 酶解時間對游離油及水解蛋白提取率的影響

酶解時間與游離油及水解蛋白提取率的關系見圖7。隨著酶解時間的延長，游離油及水解蛋白提取率逐漸增加，但當超過5 h后提取率增長趨于平穩。分析原因可能式隨著酶解時間的增加，脂蛋白復合體被充分地分解，油脂釋放增加。但是，當酶解反應進行了一段時間后，底物的減少導致油脂的釋放不會繼續增加，并且較長時間的酶解對油脂的品質有不利的影響[16]。因此，最終選定酶解時間為5 h，此時牡丹籽游離油提取率為86.21%，且酶解離心后的乳化層較少。

圖7 不同酶解時間對游離油及水解蛋白提取率的影響

2.4 破乳方法對破乳油提取率的影響

考慮到50 g原料在最佳提取工藝下乳化層較少，因此取250 g進行試驗。不同破乳方法與破乳油提取率的關系見圖8。

圖8 不同破乳方法對破乳油提取率的影響

乳化層經冷凍解凍處理后，破乳油提取率最高，達到5.78%，此時牡丹籽總清油提取率多達91.23%。分析原因可能是冷凍過程中乳狀液中的油滴結晶，可以刺入水相，以及相鄰油滴間的界面膜，從而引起油滴聚集[17]。由圖8可知，乙醇輔助處理也顯示出較好的效果，但會引入有機溶劑，致使成品油中會有微量溶劑殘留，不利于人體健康。

3 結論

試驗采用酸熱法預處理結合堿性蛋白酶酶解提取牡丹籽油，得到最佳提油工藝：牡丹籽粉按料水質量比1∶6、pH 3.5、溫度40℃、反應時間8 h。在堿性蛋白酶最適條件下，加入3%的酶量，反應5 h，此時牡丹籽游離油提取率多達86.21%，且乳化層較少。在最佳提取工藝條件下，稱取250 g牡丹籽粉進行破乳研究，得到的最佳破乳條件為冷凍解凍處理，即-20℃冷凍12 h、90℃水浴15 min、以3 500 r/min離心10 min。結果表明，破乳油提取率可達5.78%，此時牡丹籽總清油提取率可達91.23%。與多酶法提取相比，采用該工藝所得乳化層較少，游離油提取率顯著提升，且整個工藝過程沒有較高溫度，僅使用單一酶，因而有助于降低成本。