二氫楊梅素納米乳液的制備及性能評價

吳曉瓊 ，崔曉鈺 ，王強 ，夏強 *

1. 南京科技職業學院生物與環境學院（南京 210048）；2. 東南大學生物科學與醫學工程學院（南京 210096）；3. 蘇州納米科技協同創新中心（蘇州 215123）

二氫楊梅素又名蛇葡萄素，外觀為白色粉末，結構式如圖1。二氫楊梅素屬于黃酮類化合物，存在于楊梅科、藤黃科以及柳科等植物中，其中藤茶尤為特別。研究表明：二氫楊梅素具有抗菌、護肝、抗氧化等功能。但其溶液穩定性較差，易氧化、生物利用率低等缺點，限制了其應用[1-4]。

圖1 二氫楊梅素結構式

納米乳液（Nanoemulsions，NE）與傳統乳液類似，由油、水、乳化劑組成，乳化劑一般又分為主乳化劑和助乳化劑，是一類液相以液滴形式分算到另一相中形成的膠體分散體系。和傳統乳液相比，納米乳液的粒徑更小，常在100 nm左右，較小的粒徑賦予粒子更大的表面積，使得活性物更容易被吸收，可提高口服生物利用度，并可能增強活性物的效用[5-6]。研究主要制備二氫楊梅素納米乳液，改善其溶解度、穩定性和生物利用度，使其在功能性食品領域發揮其應用。

1 材料與方法

1.1 材料

二氫楊梅素（98%），西安天豐生物科技有限公司；辛癸酸甘油酯，河南正通化工有限公司；聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯（吐溫80），國藥集團化學試劑有限公司；聚甘油蓖麻醇脂（PGPR），上海佑創實業有限公司；BS124S電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；掃描電子顯微鏡（SEM，FEI TecnaiG2F20S-Twin，USA）、單光束紫外可見分光光度計：755B型，上海菁華科技儀器有限公司；激光粒度儀（Laser Diffraction，LD），Malvem Mastersizer MS2000，英國馬爾文儀器有限公司；磁力攪拌電熱恒溫水浴鍋，EMS-30，上海喬躍電子有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 二氫楊梅素納米乳液的制備

以辛癸酸甘油酯為油相1 g，加入二氫楊梅素0.02 g，同時加入Tween 80 0.6 g，PGPR 0.6 g，30℃下攪拌混合均勻，加入去離子水7.38 g，甘油0.4 g以900 r/min的轉速攪拌15 min，即得到二氫楊梅素納米乳液。

1.2.2 二氫楊梅素含量的測定

二氫楊梅素溶液的質量濃度為橫坐標，樣品在294 nm處的吸光度為縱坐標，繪制二氫楊梅素標準曲線，方程為y=0.050 8C-0.004 6，R2=0.999 5。

圖2 二氫楊梅素的標準曲線

1.2.3 平均粒徑和多分散指數

使用激光粒度儀，測量平均粒徑（Mean particle size）和多分散指數（PDI）。多分散指數（PDI）是衡量體系中顆粒粒徑分布寬度的一個指標。測試的角度是90°，測試的溫度是25℃，平衡時間為3 min。所有粒徑數據都是測試三次的平均值。

1.2.4 微觀形貌觀察

使用超純水將新制備的納米乳液稀釋50倍，滴加到銅網上自然干燥，用質量分數為1%的磷鎢酸溶液負染樣品后置于樣品室觀察。

1.2.5 保留率的測定

采用超濾離心法測定二氫楊梅素納米乳液的包封率。取400 μL樣品于超濾離心管中在12 000 r/min轉速下離心15 min，吸取濾液，用無水乙醇定容至10 mL，通過紫外分光光度計測定吸光度，根據標準曲線和稀釋倍數關系計算出游離活性物的含量（Wf），然后根據公式（1）計算二氫楊梅素納米乳液的包封率：

式中：EE為包封率；Wt為總活性物含量。

1.2.6 穩定性考察

（1）離心穩定性：將制備的復合維生素納米乳液在 10 000 r/min下分別離心5，10，15和20 min，測其粒徑、PDI。

（2）儲存穩定性：將制備的復合維生素納米乳液分別儲存于4℃冰箱、常溫（25℃）、40℃恒溫箱中，每隔一段時間測其粒徑、PDI。

1.2.7 抗氧化性試驗

通過DPPH自由基清除試驗來考察二氫楊梅素納米乳液的抗氧化性，稱取8 mg DPPH于100 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容。取三個西林瓶，分別編號為D、S和B，按表1加樣并搖勻，在室溫暗處反應30 min后，檢測各瓶中液體在517 nm處的吸光度。假設D、S、B瓶中液體的吸光度分別為AD、AS、AB，則DPPH自由基清除率的計算方法見公式（2）：

表1 D、S、B瓶中液體的組成

1.2.8 體外模擬釋放

使用透析袋法考察二氫楊梅素納米乳液的體外釋放性能。選用PBS緩沖溶液（pH 6.8）-乙醇（7∶3，V/V）作為釋放介質。精確稱取2 mL的樣品于透析袋中，并用透析夾夾緊兩端。將透析袋完全浸沒在200 mL釋放介質的燒杯中，在37℃的水浴條件下保持150 r/min的勻速磁力攪拌。分別在0.5，1，2，4，6，8，10，12和24 h從燒杯中取5 mL釋放介質，對其中二氫楊梅素含量進行檢測，并加入5 mL釋放介質，保證燒杯中的釋放介質總量不變。以時間為橫坐標，二氫楊梅素釋放量為縱坐標，繪制二氫楊梅素納米乳液的體外釋放曲線。以相同量的二氫楊梅素水溶液作為空白對照組。

2 試驗結果

2.1 復合二氫楊梅素納米乳液的基本參數

經測定，制備的二氫楊梅素納米乳液的包封率為92.4%±0.4%。對二氫楊梅素納米乳液的平均粒徑進行了檢測，平均粒徑為86.85±0.54 nm，PDI為0.099± 0.002，通過透射電鏡觀察二氫楊梅素納米乳液顆粒形貌結構，結果如圖3所示。表明所制備的二氫楊梅素納米乳液具有較小的粒徑，且粒徑分布均一。

圖3 二氫楊梅素納米乳液透射電鏡圖

2.2 穩定性考察

2.2.1 儲存穩定性

通過對置于不同溫度下的二氫楊梅素納米乳液進行粒徑和PDI的檢測，考察制備的二氫楊梅素納米乳液在4和25℃下的穩定性，選擇合適的儲存溫度。試驗結果如圖4和圖5所示，從圖中可以看出，4和25℃下的的粒徑基本變化不大，但25℃下的二氫楊素梅納米乳液PDI波動較大，而4℃下二氫楊梅素納米乳液較穩定，可能是因為溫度較低時，分子熱運動減弱，較少出現聚集。考察結果表明所制備的二氫楊梅素納米乳液在低溫下穩定性更好，最好在4℃下儲存。

圖4 二氫楊梅素納米乳液在25℃下儲存28 d的平均粒徑和PDI變化

圖5 二氫楊梅素納米乳液在4℃下儲存28 d的平均粒徑和PDI變化

2.2.2 離心穩定性

離心法是一種簡單且快速評價體系穩定性的方法。如圖6所示，從圖中可以看出，二氫楊梅素納米乳液在不同的離心時間下，粒徑無顯著變化，無分層現象；且從PDI可以看出，體系內均沒有出現較大顆粒的聚集。表明二氫楊梅素納米乳液具有較好的離心穩定性。

圖6 二氫楊梅素納米乳液離心不同時間后的平均粒徑和PDI變化

2.3 抗氧化性考察

抗氧化性是二氫楊梅素的主要功效之一，與其的應用具有重要的關系。試驗選擇DPPH自由基清除試驗考察所制備的二氫楊梅素納米乳液的抗氧化性能。DPPH是一種穩定性較好的以氮為中心的自由基，紫色，在517 nm處具有強吸收，當溶液中具有自由基清除劑時，DPPH會與其結合，致使溶液在517 nm處的吸光度降低，且降低量與清除DPPH的量呈線性關系。

表2為二氫楊梅素納米乳液、二氫楊梅素乙醇溶液、空白納米乳液對DPPH自由基清除率。從試驗結果可以看出，空白的納米乳液對DPPH自由基清除率很低，幾乎不具備抗氧化性。而相對于二氫楊梅的乙醇溶液，二氫楊梅素納米乳液的清除率出現了一定的降低?？赡苁侵苽溥^程中存在一些物質導致二氫楊梅素氧化，降低了二氫楊梅素的DPPH自由基清除率。

表2 不同樣品的DPPH自由基清除率

2.4 體外釋放研究

體外釋放是考察微納米載體性能的重要指標。本試驗采用透析袋法考察二氫楊梅素納米乳液的體外釋放行為。本試驗選擇了PBS緩沖溶液（pH 6.8）-乙醇（7∶3，V/V）作為釋放介質。試驗結果如圖7所示，從圖中可以看出，在體外37℃二氫楊梅素納米乳液24 h累計釋放率為72.3%，而二氫楊梅素水溶液在12 h基本釋放完全，說明二氫楊梅素納米乳液具有一定的緩釋作用。

圖7 二氫楊梅素納米乳液的累計釋放曲線

3 結論

所制備的二氫楊梅素的平均粒徑為86.85±0.54 nm，PDI為0.099±0.002，制備得到的體系中二氫楊梅素含量為0.191%±0.005%，包封率為92.4%±0.4%。通過對穩定性的考察，可以知道二氫楊梅素納米乳液最好在低溫下儲存，且離心穩定性良好。抗氧化性能研究表明二氫楊梅素納米乳液具有明顯的抗氧化性能。體外釋放的考察結果，表明二氫楊梅素納米乳液對活性物具有緩釋的效果。二氫楊梅素納米乳液可提高生物利用率，為功能化食品提供了更大的可能性。