花生紅衣多酚-鋅配合物的制備及其抗氧化性質(zhì)

王翠蓮，武曉煒，陽嘉，姜欣伶，王越，李海燕*

魯東大學(xué)食品工程學(xué)院（煙臺 264025）

花生紅衣是花生加工的副產(chǎn)物，我國每年在花生加工過程中產(chǎn)生的花生紅衣總量近千噸，資源豐富。花生紅衣除少量用作中藥外，大多數(shù)被當(dāng)作廢棄材料制成動物飼料，經(jīng)濟(jì)價(jià)值非常低[1]。花生紅衣中含有豐富的多酚類物質(zhì)，這些多酚類物質(zhì)具有很好的生物活性，如降血糖、降血脂、抗氧化、抗腫瘤等[2-4]。

多酚分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)酚羥基，可以發(fā)生醚化、苷化等反應(yīng)，能與金屬離子發(fā)生螯合作用。有研究表明，多酚成分與金屬離子結(jié)合后，其生物活性得到顯著增加，甚至可以產(chǎn)生新的藥理作用[5-7]。多酚螯合鋅與氨基酸螯合鋅類似，分子量較小，較易通過腸壁從而被人體吸收，且不受外界環(huán)境pH影響，即使在胃部pH較低條件下，依然能穩(wěn)定存在而不被分解，最終被人體所利用吸收，具有極高生物效價(jià)[8-10]。花生紅衣多酚與金屬離子的螯合作用還未見相關(guān)報(bào)道，花生紅衣多酚與金屬離子的配合物可能同時(shí)兼有多酚與金屬離子的生物活性，從而使得花生紅衣多酚的應(yīng)用更加廣泛。

試驗(yàn)利用超聲波輔助法乙醇提取花生紅衣多酚，將多酚與Zn2+進(jìn)行配位，制備花生紅衣多酚-Zn配合物（PSP-Zn），并研究其抗氧化性質(zhì)。為花生紅衣多酚更好應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等行業(yè)提供理論支持[6-7]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生紅衣（山東魯花集團(tuán)）；DPPH（分析純，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司）；硫酸鋅（分析純，天津市廣成化學(xué)試劑有限公司）；大孔吸附樹脂AB-8（分析純，天津浩聚樹脂科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

低速大容量離心機(jī)（LXJ-IIB，上海安亭科學(xué)儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52B，上海亞榮生化儀器廠）；可見分光光度計(jì)（721G，上海圣科儀器有限公司）。

1.3 花生紅衣多酚的提取、純化及含量測定

1.3.1 花生紅衣多酚的提取

花生紅衣多酚提取工藝參考劉曉艷等[11]和任虹等[12]的研究。具體操作為：將花生紅衣粉末過40目篩備用。準(zhǔn)確稱取1.0 g花生紅衣粉末，放于燒杯中，按料液比1∶90（g/mL）加入體積分?jǐn)?shù)56%的乙醇試劑，在超聲功率240 W條件下超聲25 min進(jìn)行多酚提取，提取結(jié)束后離心提取液，去掉殘?jiān)∩锨逡哼M(jìn)行旋蒸，除去提取液中的乙醇。將旋蒸后的提取液轉(zhuǎn)移于100 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度線，備用。

1.3.2 花生紅衣多酚的純化

取40 mL活化后的濕樹脂裝柱，將多酚粗提液進(jìn)行上樣，充分吸附3 h，用2倍樹脂體積的蒸餾水以1.5 mL/min流速洗去雜質(zhì)，之后分別用20%、60%的乙醇溶液以1.5 mL/min的流速進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液，旋蒸除去乙醇后，真空干燥得到花生紅衣多酚（PSP），經(jīng)測定PSP多酚含量達(dá)80%。

1.3.3 花生紅衣多酚含量的測定

參照酒石酸亞鐵比色法。量取1 mL提取液于25 mL容量瓶中，加入4 mL與提取時(shí)相同濃度的乙醇溶液，搖勻后加入5 mL酒石酸鐵溶液，搖勻。用pH 7.5的緩沖液定容，充分混合，靜置30 min顯色后，測其在波長540 nm處的吸光度。

1.4 PSP-Zn的制備及螯合率的測定

1.4.1 PSP-Zn的制備

按照一定的質(zhì)量比加入與花生紅衣多酚質(zhì)量濃度（1.2 mg/mL）相同的ZnSO4溶液，用玻璃棒充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆磻?yīng)。用檸檬酸和碳酸氫鈉將溶液調(diào)至一定的pH，在一定水浴溫度下螯合30 min后，在4 000 r/min的離心條件下離心10 min，除去沉淀物，收集上清液即為PSP-Zn[13-14]。

1.4.2 螯合率的測定

參照EDTA配位滴定法[15]滴定螯合物中的金屬元素。取5 mL質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL的PSP-Zn溶液，定容到25 mL容量瓶中，搖勻。加入3滴二甲酸橙指示劑，用0.02 mol/L EDTA溶液滴定，記下所消耗的溶液體積V0（mL）；另取相同體積的PSP-Zn溶液，加10 mL乙醇，水浴溫?zé)岢浞謹(jǐn)嚢韬笥谜麴s水定容至25 mL，搖勻。加3滴二甲酸橙指示劑，用0.02 mol/L EDTA溶液滴定，記下所消耗的溶液體積V1（mL）。通過式（1）計(jì)算出相應(yīng)的金屬離子螯合率。

1.5 花生紅衣多酚螯合工藝的單因素試驗(yàn)

1.5.1 反應(yīng)溫度對PSP-Zn制備的影響

量取5組10 mL質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL的PSP溶液，分別加入30 mL質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL的ZnSO4溶液，調(diào)至pH 7.0。分別將5組螯合的反應(yīng)體系置于30，40，50，60和70℃恒溫水浴鍋中水浴30 min，在4 000 r/min條件下離心10 min，去除沉淀收集上清液。測定金屬螯合率。每組做3組平行試驗(yàn)。

1.5.2 pH對PSP-Zn制備的影響

量取5組10 mL質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL的PSP溶液，分別加入30 mL質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL的ZnSO4溶液，分別調(diào)至pH 4.0，5.0，6.0，7.0和8.0，在40℃水浴條件下螯合30 min，以4 000 r/min離心10 min，去除沉淀收集上清液。測定金屬螯合率。每組做3組平行試驗(yàn)。

1.5.3 質(zhì)量比對PSP-Zn制備的影響

量取5組10 mL質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL的PSP溶液，分別按質(zhì)量比2∶1，3∶1，4∶1，5∶1和6∶1加入質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL的ZnSO4溶液，調(diào)節(jié)至pH 6.0，在40℃下螯合30 min，在4 000 r/min條件下離心10 min，去除沉淀收集上清液。測定金屬螯合率。每組做3組平行試驗(yàn)。

1.6 響應(yīng)面優(yōu)化PSP-Zn的制備條件

根據(jù)PSP-Zn制備的單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取反應(yīng)溫度、pH、質(zhì)量比3個(gè)因素作為自變量，以螯合率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，做三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以研究所選的3個(gè)因素對花生紅衣多酚與金屬離子螯合的綜合影響。響應(yīng)面因素水平的設(shè)計(jì)情況如表1。

表1 PSP-Zn制備工藝響應(yīng)面因素水平

1.7 抗氧化能力的測定

1.7.1 清除DPPH·能力的測定

用95%乙醇配制1×10-4mol/L的DPPH溶液備用。配制與相同濃度的PSP、PSP-Zn、VC、VE溶液。分別量取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL樣品溶液于試管中，用蒸餾水補(bǔ)至1 mL，加入1×10-4mol/L的DPPH溶液3 mL搖勻靜置30 min后于517 nm下測吸光度A。用蒸餾水代替樣品，其他條件不變，作為對照測吸光度A0，計(jì)算清除率[16]。

1.7.2 清除羥自由基能力的測定

分別量取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL PSP、PSPZn、VC、VE溶液于試管中，用蒸餾水補(bǔ)至1 mL，依次加入1 mL濃度為0.15 mol/L FeSO4溶液，1 mL濃度為2 mmol/L水楊酸溶液、1 mL濃度為6 mmol/L的過氧化氫溶液，在37℃下反應(yīng)1 h，測定510 nm處的吸光度A；用蒸餾水代替上述樣液，其他條件不變，測吸光度A0，計(jì)算清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)溫度對PSP-Zn制備的影響

反應(yīng)溫度對PSP-Zn制備的影響如圖1所示。在一定溫度范圍內(nèi)，螯合率隨反應(yīng)溫度增加而提高，多酚與Zn2+螯合率在60℃時(shí)達(dá)到最大，最大值分別為44%。花生紅衣多酚與金屬的螯合體系溫度達(dá)到最佳溫度后，金屬離子的螯合率呈現(xiàn)下降趨勢。這可能是由于較高溫度破壞多酚與Zn2+之間起螯合作用的化學(xué)鍵，從而使螯合率下降。

圖1 溫度對PSP-Zn制備的影響

2.2 pH對PSP-Zn制備的影響

由圖2可知，在酸性范圍內(nèi)，螯合率隨pH升高呈上升趨勢，說明酸性條件有利于花生紅衣多酚與金屬螯合反應(yīng)進(jìn)行；反應(yīng)體系pH 6.0時(shí)，多酚與Zn2+的螯合率達(dá)到最大值45%。反應(yīng)體系呈堿性時(shí)，多酚與金屬離子的螯合率急劇下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是由于多酚的獨(dú)特分子結(jié)構(gòu)，它可在電解液中電離出較多的氫離子，使整個(gè)反應(yīng)體系呈現(xiàn)酸性。在堿性環(huán)境中，OH-一方面可與氫離子結(jié)合，促使平衡反應(yīng)向右進(jìn)行，促進(jìn)更多多酚物質(zhì)降解；另一方面OH-本身可與Zn2+結(jié)合生成沉淀，從而減少多酚與金屬離子之間螯合物生成。

圖2 pH對PSP-Zn螯合反應(yīng)的影響

2.3 質(zhì)量比對PSP-Zn制備的影響

質(zhì)量比對PSP-Zn的螯合率影響如圖3所示。隨著金屬離子與多酚質(zhì)量比增大，螯合率呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，直至達(dá)到最佳螯合率后呈現(xiàn)基本保持不變或者下降趨勢。多酚與Zn2+的螯合率在質(zhì)量比3∶1時(shí)達(dá)到最大值47%，而后變化趨勢趨于平穩(wěn)。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化PSP-Zn的制備條件

2.4.1 因素分析及模型建立

花生紅衣多酚與Zn2+螯合反應(yīng)的響應(yīng)面因素水平的試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

利用Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后，各試驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響可用函數(shù)表示為Y=49.96- 0.38X1-2.15X2+1.09X3-1.46X12-7.68X22-2.06X32+ 0.82X1X2-0.50X1X3+0.62X2X3。

圖3 質(zhì)量比對PSP-Zn螯合反應(yīng)的影響

表2 PSP-Zn制備工藝響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

對17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析后得到的方差分析表如表3所示。

由表3可知，各因素對多酚與金屬的螯合率的影響是不同的，各因素對模型影響程度大小依次為X2＞X3＞X1，即pH影響最大，溫度影響最小。

表3 各因素方差分析

2.4.2 響應(yīng)面分析

由表3可以看出，模型的回歸顯著性水平小于0.05，說明多酚與鋅離子的螯合率與溫度、pH、質(zhì)量比之間的關(guān)系顯著，而失擬項(xiàng)不顯著，說明該方程與實(shí)際情況擬合很好。從分析結(jié)果可以看出，溫度（X1）、pH（X2）及質(zhì)量比（X3）這3個(gè)因素p值只有因素pH的p＜0.01，說明這3個(gè)因素對多酚與鋅離子的螯合率的影響情況有很大差別，只有pH顯著突出。

利用響應(yīng)面分析法對回歸模型進(jìn)行分析后，因?yàn)槭M項(xiàng)顯著，從而試驗(yàn)得不到最優(yōu)工藝條件。所有利用Design Expert軟件得出PSP-Zn制備的最優(yōu)工藝條件：反應(yīng)溫度57.82℃、pH 5.86、質(zhì)量比3.27∶1，最大螯合率為46.30%。

圖4～圖6給出利用響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，固定一個(gè)因素時(shí)，另外2個(gè)因素的交互作用對螯合率的影響情況的響應(yīng)面3D圖和等高線圖。等高線為圓形時(shí)說明兩個(gè)因素的交互作用不顯著，為橢圓形時(shí)則說明這2個(gè)因素的交互作用顯著。溫度、pH、質(zhì)量比這3個(gè)因素的交互作用均為顯著。

圖4 溫度與pH的交互作用對PSP-Zn制備的影響

圖5 溫度與質(zhì)量比的交互作用對PSP-Zn制備的影響

圖6 pH與質(zhì)量比的交互作用對PSP-Zn制備的影響

2.5 PSP-Zn的抗氧化活性研究

2.5.1 PSP-Zn清除DPPH自由基的活性

DPPH自由基的電子可以與抗氧化劑反應(yīng)從而降低自由基濃度[17-19]，PSP-Zn中游離羥基數(shù)目影響其與DPPH自由基結(jié)合的反應(yīng)速度[20]。花生紅衣多酚的提取液（PSP）、VC、VE溶液及PSP-Zn清除DPPH自由基能力如圖7所示。

結(jié)果表明，所有樣液均具有一定清除DPPH自由基能力，且清除能力與自身濃度呈正比，即濃度越高，清除能力越強(qiáng)。質(zhì)量濃度為1 200 μg/mL時(shí)，PSP-Zn對DPPH清除率為84%，明顯高于PSP的70%，說明PSP螯合鋅離子后清除DPPH能力顯著提高。與同濃度VC和VE相比，PSP-Zn的清除DPPH能力也較強(qiáng)。總體上來說，多酚及其金屬配合物清除DPPH自由基的能力要高于VE、VC溶液且清除能力較強(qiáng)。

圖7 PSP-Zn對DPPH自由基的清除能力

2.5.2 PSP-Zn清除羥自由基的活性

羥自由基幾乎能與活細(xì)胞內(nèi)的所有物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，是危害性很大的活潑性氧自由基之一[21-23]。由圖8可知，PSP-Zn清除羥自由基的能力與未螯合前PSP相比有所下降，即二者濃度相同時(shí)（1 200 μg/mL），PSP-Zn對羥自由基清除率為23.40%，低于PSP對羥自由基清除率27.71%。同濃度的VC、VE溶液的清除能力要明顯高于PSP和PSP-Zn。

圖8 PSP-Zn對羥自由基的清除能力

總體上來說，多酚及其多酚金屬配合物在清除羥自由基方面的能力要弱于清除DPPH自由基的能力。分析其原因可能是，試驗(yàn)過程采用的是花生紅衣多酚粗提物，含有其他雜質(zhì)，影響金屬的配合及產(chǎn)物的抗氧化性質(zhì)。此外，植物多酚的酚羥基及其多酚分子結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性使其具有抗氧化活性[23-25]，花生紅衣中多酚種類及結(jié)構(gòu)也復(fù)雜不同，有關(guān)其金屬配合物結(jié)構(gòu)及抗氧化作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

試驗(yàn)選用山東煙臺當(dāng)?shù)鼗ㄉ庸じ碑a(chǎn)物花生紅衣為原料，采取超聲波輔助乙醇提取花生紅衣多酚。將提取的花生紅衣多酚與Zn2+進(jìn)行配位，制備花生紅衣多酚-Zn2+配合物（PSP-Zn），并考察影響金屬螯合率的3個(gè)因素：溫度、pH、質(zhì)量比。通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)確定最佳螯合條件。結(jié)果表明，PSP-Zn的最佳制備工藝為：反應(yīng)溫度57.82℃，pH 5.86，質(zhì)量比4.27∶1。多酚與鋅離子的最大螯合率為46.30%。

PSP-Zn的抗氧化性質(zhì)研究結(jié)果顯示，在清除DPPH自由基能力方面，PSP-Zn有較強(qiáng)的清除能力，高于同濃度VC、VE溶液，且隨著濃度升高，清除能力呈上升趨勢；而在清除羥自由基能力方面，PSP和PSP-Zn的清除能力都要低于同濃度VC、VE溶液，且PSP-Zn的清除能力要略低于PSP。PSP-Zn的性質(zhì)及構(gòu)效關(guān)系還需進(jìn)一步研究。PSP-Zn的制備和抗氧化性質(zhì)研究可為新型抗氧化劑的開發(fā)提供思路，也為花生紅衣的高值化利用提供試驗(yàn)依據(jù)。