人參皂苷Rd對U251神經膠質瘤細胞凋亡的影響*

楚麗麗，宛蕾

(貴州醫科大學 基礎醫學院 藥理教研室,貴州 貴陽 550004)

人參皂苷Rd(ginsenoside Rd,GS-Rd)是從中藥人參中分離的單體成分，屬于稀有皂苷，在三七中約含0.36%～1.47%[1]，可由人參皂苷Rb-1經腸道酶代謝獲得，是皂苷經腸道吸收利用的形式之一。人參皂苷Rd具有抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡和分化、抑制其生長和轉移的作用；還可抗疲勞、調節中樞神經系統、改善心腦血管、提高機體免疫力[2-7]。此外，還有提高學習能力、抗衰老[8-9]、抗潰瘍性結腸炎[10]、抗肝纖維化[11和抗炎鎮痛[12-14]等作用。神經膠質瘤是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，發病率約占腦腫瘤的46%[15]，5年生存率不超過5%[16]，預后差易復發[17]。目前此病的發病機制尚不完全清除，其發生發展過程受多因素多步驟影響[18]。傳統治療方法以手術及術后放化療為主，但此腫瘤呈侵襲性生長，完全清除難度高，且目前使用的放化療藥物對機體正常組織造成傷害的同時易產生耐藥性[19]。人參皂苷Rd屬脂溶性小分子物質，生物活性較強，對正常細胞無毒，在誘導大腸癌、肺癌、乳腺癌和黑色素瘤等細胞凋亡方面的研究已有報道，但對治療膠質細胞瘤方面尚未見報道。因此本研究通過觀察人參皂苷Rd對神經膠質瘤U251細胞凋亡的影響并探討可能的機制，為其在神經膠質瘤治療中的應用提供基礎研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗藥物：人參皂苷Rd(純度90%以上)，貴州信邦制藥股份有限公司。細胞株：U251細胞系購于中國科學院上海細胞庫。試劑：MTT(四甲基偶氮唑藍)購自北京鼎國生物技術有限責任公司，1,2-丙二醇(批號930309)，購自重慶東方試劑廠，Hoechst33258(碧云天生物技術研究所)，兔抗CyclinD1單克隆抗體(批號13670111)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。儀器：熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS IX71，日本)，流式細胞儀FACS-Cabiber(美國BD)。

1.2 試驗方法

1.2.1細胞培養 U251細胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，2～3 d換液1次。

1.2.2Hoechst 33258熒光染色法檢測細胞凋亡 實驗分空白對照組和低(20 μmol/L)、中(40 μmol/L)、高(80 μmol/L)劑量人參皂苷Rd組。將即用型細胞爬片放入6孔板中，U251細胞以2×107/L密度均勻接種于玻片上培養，低、中、高劑量人參皂苷Rd干預48 h，經 Hoechst33258染色后在熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3流式細胞術Annexin-V FITC/PI雙染檢測細胞凋亡率 U251細胞給藥處理48 h后收集，冷PBS液洗滌后離心棄上清，加入Binding Buffer繼續離心棄上清，樣本管加AnnexV-FITC 2.5 μL、PI 2.5 μL，并加入細胞懸液 100 μL，室溫避光孵育15 min?？瞻讓φ展苤患尤爰毎麘乙?00 μL，使用FACSCalibur流式細胞儀(美國 BD公司)收集細胞 30 000個，Cellquest 軟件分析檢測細胞凋亡率。

1.2.4流式細胞術PI染色檢測細胞周期 接種細胞2×109/L，17 h后細胞貼壁生長后給予不含血清的高糖DMEM溶液培養24 h，給予低、中、高劑量人參皂苷Rd處理48 h。收集細胞密度達到 1×109/L，加入PBS 1.0 mL 混勻，1 000 r/min 離心5 min，棄上清；冷PBS液洗滌2次，再以2 000 r/min，室溫離心5 min。棄上清后加入含RNase A的PI染液l mL，37 ℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.5免疫細胞化學法檢測CyclinD1蛋白表達 采用PV二步免疫組化法染色：消化細胞并計數，將細胞以2×107/L密度接種于預先放置細胞爬片的6孔板中，置 37 ℃培養箱中孵育，各組給予相應處理后取出細胞爬片自然干燥，4%多聚甲醛室溫固定30 min、0.01 mol/L PBS洗5 min×3次；用0.3% TritionX-100 PBS液通透細胞膜10 min、0.01 mol/L PBS洗5 min×3次；3% H2O2去離子水孵育10 min，阻斷內源性過氧化物酶，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次；分別滴加兔抗人CyclinD1抗體，置于濕盒內4 ℃過夜；次日取出濕盒室溫下復溫60 min、0.01 mol/L PBS 洗5 min×3次；滴加二抗，37 ℃孵育30 min、0.01 mol/L PBS 洗5 min×4次；滴加新鮮配置的DAB顯色7 min，自來水充分沖洗終止染色；之后浸入蘇木素染色液復染20 s，自來水沖洗終止復染；梯度酒精脫水(70%、80%、90%、95%、100%)，二甲苯溶液透明5 min×2次，中性樹膠封片，倒置顯微鏡下觀察拍片并對結果進行統計學分析。

1.3 統計學方法

應用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，組間比較用單因素方差分析進行統計學處理，兩兩比較采用t檢驗；P<0.05和P<0.01認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hoechst33258熒光染色檢測人參皂苷Rd對U251神經膠質瘤細胞凋亡的影響

Hoechst33258染色結果顯示，空白對照組有少量U251細胞細胞核呈致密的強熒光團影并出現胞核碎塊，即出現少量凋亡細胞；人參皂苷Rd低、中、高劑量組細胞熒光強度增強且隨著濃度的增加，細胞的上述改變越明顯，與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1、圖2。

注：A為空白對照組，B為低劑量組，C為中劑量組，D為高劑量組，箭頭所示為細胞凋亡小體。圖1 Hoechst33258熒光染色檢測人參皂苷Rd對U251細胞凋亡的影響(200×)Fig.1 The effect of ginsenoside Rd on U251 cell apoptosis by Hoechst33258 fluorescence staining(200×)

2.2 流式細胞術Annexin-V FITC/PI雙染檢測人參皂苷Rd對U251神經膠質瘤細胞凋亡率的影響

人參皂苷Rd處理之后U251細胞的損傷中以早期凋亡細胞為主，低、中、高劑量組隨著藥物濃度的增加細胞早期凋亡率也隨之增加，與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.1)。見圖2。

注：(1)與空白對照組比較，P<0.01。圖2 Hoechst33258熒光染色、流式細胞術Annexin-V FITC/PI雙染檢測人參皂苷Rd對U251細胞凋亡率的影響Fig.2 The effect of ginsenoside Rd on apoptotic rates by Hoechst33258 fluorescence staining and Annexin-V FITC/PI staining

2.3 人參皂苷Rd對U251細胞周期的影響

低、中、高劑量組U251細胞G0/G1期比例隨藥物濃度增加逐漸增高，差異有統計學意義(P<0.01)。與空白對照組比較，低、中劑量組S期所占比例降低，低、中、高劑量組G2/M期所占比例降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

注：與空白對照組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖3 人參皂苷Rd對U251細胞周期的影響Fig.3 The effect of ginsenoside Rd on U251 cell cycle

2.4 人參皂苷Rd對U251神經膠質瘤細胞CyclinD1蛋白表達的影響

低、中、高劑量組作用于U251細胞后，倒置顯微鏡下觀察CyclinD1陽性表達部位在細胞核，免疫組化方法染色呈棕黃色。結果顯示，空白對照組中CyclinD1蛋白表達顏色深，且細胞表達數目多；而人參皂苷Rd低、中、高劑量組，CyclinD1蛋白表達顏色變淺，與空白對照組相比，低劑量組、中、高劑量組且細胞表達數目均減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4、圖5。

3 討論

目前研究表明，腫瘤發生和細胞周期進程有密切聯系[20-21]，也就是說腫瘤是一類細胞周期性疾病。細胞周期蛋白在細胞周期進程中G1-S、G2-M轉換的兩個關卡進行調控，其中G1期是決定細胞周期長短的限速期，細胞一旦跨過此點，反復進入細胞周期，直接導致細胞惡性增殖，這是發生腫瘤的根本原因。CyclinD1參與細胞周期G1到S期的轉換[22]，起著重要的正性調控作用，在腫瘤的發生發展過程中起著至關重要的作用。CyclinD1最早出現于G1期早期，正常情況下呈一過性表達；但是過度表達時可與CDK4/CDK6形成蛋白復合物，激活CDK4和CDK6的活性，蛋白激酶磷酸化失活，使細胞增殖對有絲分裂原的依賴性降低，周期調節失控G1期縮短、促進細胞增殖、抑制細胞凋亡[23]，最終發生癌變[24-25]。由此可見，CyclinD1表達減少能有效抑制CyclinD-CDK4/CDK6復合物生成，從而不能越過G1期限制點，將細胞阻滯在G0/G1期，不能由靜止狀態進入細胞周期，影響細胞增殖。本研究顯示，通過常用的血清饑餓法誘導U251細胞停留在G0期，給予Rd作用之后，隨著藥物濃度的增加，G0/G1期所占細胞周期的比例逐漸增加，S期也一定的下降趨勢，同時CyclinD1表達率也逐漸下降。與上述通過CyclinD1表達減少，使其不能越過G1限定點，并將細胞阻滯于G0/G1期，使細胞周期發生紊亂相吻合。

注：與空白對照組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖4 人參皂苷Rd對U251細胞CyclinD1蛋白表達的影響Fig.4 The effect of ginsenoside Rd on the expression of CyclinD1egg white in U251 cells

注：A為空白對照組，B為低劑量組，C為中劑量組，D為高劑量組，箭頭所示為CyclinD1陽性表達。圖5 人參皂苷Rd對U251細胞CyclinD1蛋白表達的影響(PV，×200)Fig.5 The effect of ginsenoside Rd on CyclinD1 expression(PV，×200)

綜上所述，人參皂苷Rd可以有效的抑制神經膠質瘤U251細胞的增值，并將細胞阻滯在G0/G1期，其作用可能是通過下調CyclinD1的表達有關，但具體的分子機制需要進一步完善。本實驗研究為開發人參皂苷Rd成為新的治療神經膠質瘤的候選藥物提供了基本的實驗依據。