消痛靈噴霧劑的工藝優化及對小鼠的抗炎鎮痛作用*

梁語嫣，彭梅，楊小生1,，陳發菊，羅忠圣，楊禮壽，鄧廷飛，王麗，王道平，楊娟1,***

(1．貴州醫科大學 藥學院，貴州 貴陽 550025;2.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550014)

消痛靈噴霧是本課題組研發的一種治療跌打損傷的中藥復方制劑，由透骨香、防風等幾味藥材組成，透骨香在配方中作為君藥。透骨香Gaultheriayunnanensis(Franch.)Rehd 為杜鵑花科植物滇白珠全草或根[1]，有抑菌、抗氧化、活血通絡[2]、順氣平喘[3]的功效，被我國少數民族廣泛用于治療風濕性關節炎[4-5]。現代藥理學研究顯示，透骨香中的水楊酸具有消炎鎮痛、殺菌等多重藥效作用，長期以來一直作為臨床藥物被廣泛使用[6-7]，因此，在制備消痛靈工藝條件中，以配方中的水楊酸含量作為考察指標。課題組的前期研究基礎表明，消痛靈噴霧劑的配方中主要含揮發油等成分，噴霧劑中的揮發性成分對小鼠跌打損傷也具有比較顯著的治療作用。因此為了保證消痛靈噴霧劑臨床療效的穩定性和連續性，本研究在不破壞配方的揮發性成分的基礎上，沿用民間外敷或榨汁擦抹的方法，在制備工藝中采用乙醇為提取溶劑、冷浸法進行提取，以透骨香中水楊酸為指標，選擇4個因素運用L9(43)正交實驗，選出最佳制備工藝；并采用最佳工藝制備消痛靈噴霧，觀察該噴霧劑對二甲苯致小鼠耳腫脹、蛋清所致小鼠足腫脹及醋酸致小鼠扭體的影響，為藥物的進一步開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 昆明種小鼠，體質量(20±2)g，雌雄各半，中國人民解放軍第三軍醫大學實驗動物中心提供。合格證號SCXK-(軍)2012-0011。

1.1.2藥物 透骨香、防風等4種藥材(購買于貴州貴陽市萬東橋中藥材市場)，貴州中醫藥大學孫慶文教授鑒定為正品。云南白藥氣霧劑(國字標準Z53021107)。

1.1.3試劑及儀器 冰醋酸(成都市科龍化工試劑廠)，食用乙醇、二甲苯(天津富宇精細化工公司)，水楊酸(中國食品藥品檢定研究院，批號NIC-100106)，甲醇(色譜純，上海星可高純溶劑有限公司)，UV-1800型紫外分光光度計(日本島津公司)，1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)，JA2003精密電子天平(上海浦春劑量儀器有限公司)，YLS-Q4型鼠耳打孔器(北京吉安得爾科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1正交試驗設計[8-9]通過預實驗確定水楊酸提取主要影響因素為乙醇濃度、料液比、滲漉時間及粉碎度，從而選取浸泡天數(A)、乙醇濃度(B)、料液比(C)、粉碎度(D)作為考察因素，設計3個水平，以水楊酸的含量為指標，設計L9(43)正交實驗，見表1。

表1 消痛靈噴霧劑L9(43)正交試驗設計表Tab.1 Orthogonal test design of Xiaotongling spray L9 (43)

注：A為浸泡天數，B為乙醇濃度，C料液比為，D為粉粒度。

1.2.2水楊酸含量測定[10-11]色譜柱為Gemini-Nx色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，流動相為甲醇-水(甲醇與水為35 ∶65)，檢測波長306 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，進樣量為5.0 μL，理論板數按水楊酸計應不低于3 000 。

1.2.3制備試藥 將透骨香、防風等4味藥材按本課題組前期研究的藥材比例稱取共50.00 g，置于1 000 mL錐形瓶中，按工藝優選后的乙醇濃度、料液比、浸泡時間，粉碎粒，依照冷浸法，過濾，稀釋為乙醇濃度40%，待用。消痛靈噴霧劑以優選出最佳工藝制備作為高劑量(以含生藥材量計0.16 g/L)。

1.2.4二甲苯致小鼠耳腫脹實驗 50只小鼠隨機均分為對照組(生理鹽水)、陽性組(云南白藥噴霧劑)、消痛靈噴霧劑高、中、低劑量組(0.16、0.08及0.04 g/L)，將相應藥物涂于小鼠耳部與腹部，3次/d，連續5 d。第5天各組小鼠右耳兩面均勻涂抹相應藥物1 次，給藥30 min 后，各組小鼠右耳兩面均勻涂抹二甲苯30 μL，2 h后麻醉狀態下處死小鼠，剪下左右耳，用直徑8 mm 打孔器打下同一部位耳片，稱取質量，計算腫脹率及抑制率[12-14]。

1.2.5對小鼠蛋清所致足腫脹的影響[15-17]分組及給藥時間同“1.2.4”，將各組相應藥物涂于小鼠足部與腹部。末次給藥前以螺旋測微儀測量右后足跖厚度，作為致炎前右后足正常厚度，在末次給藥30 min 后，取10%(v/v)雞蛋清生理鹽水溶液0.1 mL于小鼠右后足跖中部皮下注射致炎并標記，并記錄注完時間。分別測量各組小鼠致炎前后0.5、1及2 h右后足跖厚度，減去致炎前足跖厚度，計算足腫脹。

1.2.6醋酸扭體實驗[18-20]分組及給藥時間同“1.2.4”，各組小鼠腹部去毛，暴露2 cm×2 cm的皮膚為給藥區。末次給藥30 min后，每只小鼠腹腔注射1%冰醋酸0.2 mL，記錄注射后15 min 內小鼠扭體次數。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 正交試驗及方差分析

以表2中的極值R進行分析，各指標因素影響的主次順序是A>B>C>D，根據K值進行比較可得，A因素中K3值最大，B因素中K2值最大，C因素中K2值最大，D因素中K1值最大。表3中，將離差平方和中最小的項近似作為誤差的估計，用來計算各因子列的F比值，可以看出A因素的3個水平存在較大差異，對實驗的結果影響較大，B、C和D因素的3個水平對實驗結果影響較小，結合表3方差分析可以得出最佳提取工藝為A3B2C2D1，即最佳方案：浸泡時間為7 d、濃度為75%乙醇、液料比為 1 ∶5，藥材過10目篩大小，使用時將配置出的配方稀釋至含乙醇濃度為40%即可。

2.2 消痛靈噴霧對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響

結果顯示，不同劑量組治療后的腫脹抑制率存在差異，各治療組均有抑制作用，其中中劑量組顯著抑制二甲苯所致耳廓腫脹，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，且腫脹率、抑制率接近陽性組。見表4。

表2 消痛靈噴霧劑L9(43)正交試驗結果Tab.2 Orthogonal test results of xiaotongling spray L9 (43)

注：A為浸泡天數，B為乙醇濃度，C料液比為，D為粉粒度，R為同列Ki的極值。

表3 消痛靈噴霧劑制備工藝方差分析表Tab.3 Variance analysis table of preparation process of xiaotongling spray

注：A為浸泡天數，B為乙醇濃度，C料液比為，D為粉粒度。

表4 消痛靈噴霧劑對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響Tab.4 Effects of xiaotongling spray for xylene-induced ear swelling in mice

注：“-”為不做計算，(1)與對照組比較，P<0.05。

2.3 消痛靈噴霧對蛋清致小鼠足腫脹影響

結果顯示，與對照組比較，消痛靈噴霧劑高、中劑量組給藥30 min及給藥90 min，高劑量組給藥60 min，小鼠足趾腫脹度均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 消痛靈噴霧劑對蛋清致小鼠足跖腫脹的影響Tab.5 Effects of xiaotongling spray for egg white-induced paw swelling in

注：(1)與對照組比較，P<0.05。

2.4 消痛靈噴霧對醋酸所致小鼠疼痛的影響

結果顯示，與對照組比較，各治療組均能在一定程度上抑制醋酸所致的疼痛反應，注射后15 min內小鼠扭體次數減少，但與空白對照組比較，僅高劑量組小鼠扭體次數顯著減少，差異有統計學意義(P<0.05)，表明消痛靈噴霧劑對醋酸引起的疼痛有顯著的抑制作用。見表6。

表6 消痛靈噴霧劑對醋酸致小鼠疼痛的影響Tab.6 Effects of xiaotongling spray one pain

注：(1)與對照組比較，P<0.05。

3 討論

炎癥是人類疾病中最廣泛、最常見的病理過程，是具有血管系統的活體組織對局部損傷的反應。許多研究證明，炎癥的發生往往伴隨著疼痛反應，并相互影響。本研究中的消痛靈噴霧劑為透骨香，防風等幾味藥材組成的復方制劑，其中透骨香中的水楊酸作為一種具有廣泛活性的化合物，與阿司匹林的結構母核一致，具有相應非甾體抗炎類藥物的藥效特征，很早就已被中國、日本及美國等多個國家藥典收錄[21-22]，因此選作消痛靈噴霧劑工藝優化的考察指標?？紤]到組方藥材中含有揮發性物質，因此采用冷浸法對其制備，以減少有效物質損失[23]。課題組的前期研究基礎表明，消痛靈噴霧劑的配方中主要含揮發油等成分，噴霧劑中的揮發性成分對小鼠跌打損傷也具有比較顯著的治療作用。因此為了保證消痛靈噴霧劑臨床療效的穩定性和連續性，以及進一步對消痛靈噴霧劑藥效學研究提供數據參考。本研究在不破壞配方的揮發性成分的基礎上，沿用民間外敷或榨汁擦抹的方法，制備工藝中采用乙醇為提取溶劑，冷浸法進行提取，以透骨香中水楊酸為指標，選擇4個因素運用L9(43)正交實驗，篩選其最佳制備工藝，得出消痛靈噴霧劑的最佳提取工藝為A3B2C2D1，即最佳方案為浸泡時間為7 d、濃度為75%乙醇、液料比為1 ∶5，藥材過10目篩大小，使用時將配置出的配方稀釋至含乙醇濃度為40%即可。

為了研究最優工藝條件制備的消痛靈噴霧對小鼠消炎及鎮痛效果，本研究選用的2種炎癥動物模型(小鼠足腫脹及小鼠耳腫脹)，屬于急性炎癥模型，可引起組胺、5羥色胺(5-HT)等炎癥介質的釋放，導致局部毛細血管通透性亢進、滲出和水腫，紅、腫、熱、痛等早期急性炎癥表現[24-25]。實驗結果表明，與空白組比較，消痛靈噴霧劑中劑量組顯著抑制二甲苯致小鼠耳腫脹，同時，高、中劑量組從致炎30 min開始可明顯抑制足腫脹可持續到90 min，表明消痛靈噴霧劑具有較強抗炎作用。在鎮痛實驗中，高劑量組能明顯減少醋酸致小鼠能扭體次數，且其抑制率與陽性對照組相當。

綜上所述，消痛靈噴霧劑的制備工藝為，浸泡時間7 d、75%濃度乙醇、液料比為 1 ∶5、藥材過10目篩大小，在最佳工藝條件下制備的消痛靈噴霧劑具有較好的抗炎鎮痛效果，為該產品的進一步開發提供了實驗依據。