PROX1-AS1和PRICKLE2-AS1基因多態性與中國漢族人群2型糖尿病的相關性*

陶文玉，李傳印，楊瑩，楊曼，王曉苓，角銘，何思琦，洪超，李奕平**

(1.云南省第二人民醫院 &昆明醫科大學第四附屬醫院 內分泌代謝科，云南 昆明 650021；2.中國醫學科學院 &北京協和醫學院，醫學生物學研究所，云南 昆明 650118)

最新流行病學數據顯示，中國糖尿病發病率已達10.9%[1]，T2DM個體約占糖尿病總數的90%以上。研究發現，T2DM可能是由遺傳和環境因素共同導致[2]。人類基因組序列中75%具有轉錄活性[3]，而基因組轉錄產物中非編碼RNA(non coding RNA，ncRNA)占絕大多數[4]。長鏈非編碼RNA基因(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度超過200nt ncRNA，可作為信號分子參與轉錄調控、RNA蛋白復合物在胞質的定位以及分子裝配等多種生物學過程以及基因表達調控[5-6]，目前已成為疾病的新型生物標記分子或治療靶點[7]。研究顯示 lncRNA在糖代謝中發揮重要生物學作用[8-10]，而在T2DM和非糖尿病患者中lncRNA存在表達差異[11]。位于lncRNA基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)可通過影響lncRNA的結構和穩定性，影響其表達或改變其功能，這可能會影響疾病易感性[12-13]。近年來，全基因組關聯分析(genome-wide association studies，GWAS)結果已顯示lncRNA基因多態性可能與T2DM相關[14-15]。本研究選取PROX1-AS1基因rs2075423和PRICKLE2-AS1基因rs12497268的lncRNA多態性位點，分析其與中國漢族人群T2DM發病風險的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

隨機選取2012年2月-2018年2月在云南省第二人民醫院內分泌科住院的784名T2DM患者(男495例、女289例)為T2DM組，根據世界衛生組織(WHO，1999年)診斷標準：(1)糖尿病癥狀+空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)≥7.0 mmol/L或餐后2 h血漿血糖≥11.1 mmol/L，(2)若無糖尿病癥狀，需兩次血糖檢測異常。隨機選取846名參加體檢的非糖尿病個體(男503、女343)作為對照組，排除標準：(1)FPG≥6.1 mmol/L和(或)糖化血紅蛋白(glycosylated haemoglobin，HbA1C)≥6.2%的個體，(2)糖尿病家族史陽性個體，(3)高血壓病和冠狀動脈粥樣硬化性心臟病個體。本研究在實施前獲得了醫院倫理委員會的批準。所有參加者均是中國漢族，實驗前均簽署知情同意書，相互之間無血緣關系。

1.2 研究方法

1.2.1臨床實驗室檢測項目 空腹12 h清晨抽靜脈血，采用HITACHI 自動分析儀7600-020測定FPG；用酶法測定總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)；免疫比濁法測定HbA1C。

1.2.2DNA提取 使用血DNA提取試劑盒(QIAamp Blood Mini Kit，Qiagen)抽提基因組DNA。

1.2.3基因型測定 采用質譜法(MassArray Analyzer 4.0,Agena,Inc)對PROX1-AS1基因rs2075423，PRICKLE2-AS1基因rs12497268基因型進行分型，采用AssayDesigner 3.1(Sequenom lnc.,San Diego,CA,USA)設計待檢SNP的PCR引物。待檢SNP基因片段的PCR反應在384孔板中進行，反應體系為5 μL(PCR混懸液4 μL及25 mg/LDNA模板1 μL)。PCR反應條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃ 20 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min共45個循環，最后72 ℃ 長延伸3 min。PCR反應產物經蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase，SAP)處理，進行單堿基延伸反應。反應產物經樹脂純化后使用MassARRAY Nanodispenser RS1000設備(Agena,Inc,San Diego,CA,USA)將終產物轉到SpectroCHIP的384孔反應板。使用MALDI-TOF質譜分析儀(Agena,Inc,San Diego,CA,USA)對SpectroCHIP結果進行讀取，TYPER4.0 s軟件獲得原始基因型數據。為保證質譜分析法對基因型檢測的準確性，每一塊384孔反應板中加入3個已知基因型(野生純合子、突變純合子、雜合子)的標準樣品作為陽性對照，同時，用水代替DNA模板作為陰性對照。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 入選個體的臨床特征

入選個體的臨床特征見表1。T2DM組和對照組年齡和性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)。T2DM組個體的糖脂代謝指標(TC、TG、LDL-C、FPG及HbA1C)顯著高于對照組個體；而HDL-C顯著低于對照組個體，差異有統計學意義(P<0.05)，提示糖脂代謝紊亂為T2DM的特征。

2.2 rs2075423及rs12497268等位基因和基因型在兩組中的分布特征

PROX1-AS1基因中的rs2075423位點及PRICKLE2-AS1基因中的rs12497268位點的等位基因頻率和基因型頻率在兩組中的分布特征見表2。哈-溫平衡分析顯示，2個SNP位點在對照組和T2DM組均符合哈-溫平衡(P>0.05)，說明本研究樣本符合群體代表性。對2個SNP位點等位基因和基因型在T2DM組合對照組的分布差異分析的結果顯示，PROX1-AS1基因rs2075423的等位基因和基因型頻率在T2DM組和對照組比較，差異有統計學意義(P<0.001或P=0.002)，該為點等位基因G可能是T2DM發生的風險因素(OR=1.394,95%CI為1.153～1.686)。而PRICKLE2-AS1基因rs12497268基因型頻率及等位基因頻率在T2DM組和對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 T2DM組和對照組一般臨床資料比較Tab.1 The clinical characteristics of the subjects in T2DM and control groups

2.3 顯性遺傳模式下rs2075423及rs12497268與T2DM的相關性

采用邏輯回歸方法分析PROX1-AS1基因中多態性位點rs2075423及PRICKLE2-AS1基因中多態性位點rs12497268在顯性遺傳模式下與T2DM的風險的相關性。結果顯示，再現性遺傳模式下，rs2075423位點的基因型G/G相對于基因型G/T+T/T來說可能是T2DM的風險因素(P<0.001,OR=1.488;95%CI為1.197～1.851)。同樣，在顯性遺傳模式下，rs12497268位點基因型G/G相對于基因型基因型G/C+C/C來說可能是T2DM發生的風險因素(P=0.027,OR=1.260;95%CI為1.027～1.545)，見表3。

3 討論

T2DM是多基因遺傳的代謝性疾病，大量研究已經證實ncRNA在T2DM發生、發展中扮演重要作用[17-18]，同時，相關性研究顯示位于ncRNA基因的SNP位點可能與糖尿病的發生發展具有相關性[19-21]。2012年，以歐洲人群為主要研究對象，Morris等[22]對34 840例T2DM個體和114 981例對照的聯合meta分析提示，PROX1-AS1基因rs2075423等位基因G為T2DM的危險因素(P=8.1×10-9;OR為1.07,95%CI為1.05～1.10)。2014年，對4個群體(歐洲人群、東亞人群、南亞人群、墨西哥和墨西哥裔美國人群)GWAS的meta分析總結提示，無論是以上4個群體中任何1個群體，還是4個群體的聯合分析，rs2075423G均為T2DM的風險等位基因[23]。不僅是病例對照研究，同年，歐洲癌癥和營養狀況前瞻性隊列研究也報道，rs2075423等位基因G發生T2DM的風險比為1.03。本研究分析了該SNP與中國漢族人群T2DM發生風險的相關性，結果顯示PROX1-AS1基因rs2075423等位基因G可能是T2DM的風險因素。以上研究結果說明lncRNAPROX1-AS1基因rs2075423可能與T2DM發生風險相關，鑒于PROX1-AS1為非編碼RNA，因此本研究推測rs2075423位點與T2DM發生風險相關的分子機制可能是通過影響lncRNAPROX1-AS1的表達或其與靶基因的相互作用。

表2 PROX1-AS1基因中rs2075423位點及PRICKLE2-AS1基因中rs12497268位點的等位基因和基因型在T2DM組和對照組的分布特征Tab.2 The allelic and genotypic distribution of rs2075423 and rs12497268 in T2DM and control groups

表3 顯性遺傳模式下PROX1-AS1基因中多態性位點rs2075423及PRICKLE2-AS1基因中多態性位點rs12497268Tab.3 rs2075423 and rs12497268 with T2DM under dominant inheritance pattern

注：(1)P值經年齡和性別校正。

而2012年，Morris等[22]對歐洲人群的研究顯示，PRICKLE2-AS1基因rs12497268等位基因G是T2DM的危險因素(P=2.1×10-2,OR=1.03;95%CI為1.01～1.07)。而本研究結果顯示，該位點等位基因可能與中國漢族人群T2DM發生風險無相關性。相似地，2019年，Kasuga等[24]對日本213名妊娠期糖尿病個體產前、產后葡萄糖耐受情況及其遺傳特征進行了分析，結果顯示，遺傳特征可能是日本婦女妊娠糖尿病的風險因素之一，而rs12497268妊娠糖尿病無相關性。以上研究結果的不一致說明rs12497268在不同人群中發揮的作用可能不同，除此之外，不同研究納入樣本量的差異也有可能會對結果產生影響。因此，該位點在T2DM發生過程中發揮的作用需要更多的相關性研究來揭示。

綜上所述，本研究選取了兩個lncRNA基因中的SNP位點，研究其與中國漢族人群T2DM發病風險的相關性。結果顯示PROX1-AS1基因rs2075423等位基G因和基因型G/G以及PRICKLE2-AS1基因rs12497268 基因型G/G可能是T2DM發生的風險因素。本研究結果說明，lncRNA基因中的SNP位點可能與T2DM的發生風險相關，這可能是通過影響成熟lncRNA的表達以及改變lncRNA的功能實現的。鑒于lncRNA在T2DM發生發展過程發揮重要作用，而lncRNA基因中的SNP位點可能會影響lncRNA在T2DM發生發展過程中發揮的作用，因此，lncRNA基因中的SNP位點有望成為T2DM的分子標記之一。