家蠅三齡幼蟲Clip-Msp基因克隆及白假絲酵母菌刺激下的時空表達*

常振策，李忠旬，修江帆，盧成，賈利娜，國果,2，吳建偉,2***

(1.貴州醫科大學 貴州省普通高等學校現代病原生物學特色重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫科大學 寄生蟲學教研室，貴州 貴陽 550025)

家蠅(Muscadomestica)攜帶多種病原體后仍能正常生存和繁殖，得益于其強大的先天免疫系統[1-4]，因此，家蠅可作為先天免疫研究的理想模型[5-6]。近年來，家蠅的免疫相關功能基因的生物學功能已經成為研究熱點，核酸轉錄水平分析其表達模式是研究功能基因的第一步。Clip-絲氨酸蛋白酶超家族屬于非消化性蛋白酶家族，參與昆蟲的先天免疫和生長發育[7]。本課題組前期研究發現，家蠅幼蟲感染白假絲酵母菌后Clip-絲氨酸蛋白酶基因(clip-serine protease gene ofmuscadomestica,Clip-Msp)表達水平增高，認為該基因與家蠅抗C.albicans感染相關[8]。目前，家蠅Clip-絲氨酸蛋白酶基因克隆表達報道甚少，也未見家蠅幼蟲感染白假絲酵母菌后Clip-絲氨酸蛋白酶基因時空表達的相關研究。為了初步探索Clip-Msp基因在家蠅抗C.albicans感染過程中的免疫功能，本研究通過克隆家蠅Clip-Msp基因，并分析Clip-Msp基因在C.albicans刺激家蠅幼蟲后的時空表達譜，為進一步研究Clip-Msp基因的分子功能和家蠅的免疫應答奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物、質粒和菌株 家蠅(Muscadomestica)三齡幼蟲為本課題組飼養，克隆感受態E.coliDH5α購自北京全式金公司，克隆載體pMD19-T購自Takara公司。

1.1.2主要試劑及儀器 Trizol Reagent、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit、基因克隆相關試劑、氨芐青霉素、SYBR Premix Ex TaqTM II (Perfect Real Time)試劑盒均購自Takara公司，固相RNase清除劑和組織RNA保存液均購自Solarbio公司。使用儀器有核酸凝膠電泳裝置及成像系統，顯微超微量注射儀，ABI PRISM 7300，Nanodrop2000。

1.2 方法

1.2.1pMD19-T/Clip-Msp克隆載體的構建 按照Trizol說明書提取家蠅三齡幼蟲總RNA，然后以總RNA為模板，按照PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit逆轉錄合成cDNA，作為Clip-Msp基因克隆時PCR擴增的模板。42 ℃時2 min，冰浴5 min基因組中的DNA。逆轉錄反應條件：37 ℃ 20 min、85 ℃ 10 s、4 ℃ 10 s。在Primer 5.0上設計Clip-Msp基因的克隆引物(SkF、SkR)，由上海生工合成。Clip-Msp基因克隆上游引物(SkF)為ATGTATACAAAAATGCAAG，下游引物(SkR)為TCACTTTGAACCTTCGCCGCTATT。Clip-Msp基因PCR擴增的反應條件：94 ℃ 5 min預變性，94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃最后延伸10 min。PCR產物用DNA凝膠試劑盒純化回收，在16 ℃將純化的PCR產物和pMD19-T載體連接12～16 h，將pMD19-T/Clip-Msp轉化至E.coliDH5α克隆感受態細胞中，LB平板(含氨芐青霉素100 mg/L)篩選陽性轉化子，轉接液體培養后提取重組質粒進行測序鑒定。

1.2.2生物信息學分析 運用DNAMAN V6.0軟件分析Clip-Msp基因的開放閱讀框及氨基酸序列；在SignaIP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)網站上分析Clip-Msp蛋白信號肽位點，在TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)上分析Clip-Msp蛋白跨膜區，在SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)上分析Clip-Msp蛋白功能結構域。

1.2.3Clip-Msp基因在家蠅幼蟲感染后的時空表達 在Oligo6.0上設計Clip-Msp和GAPDH基因的實時熒光定量PCR(Real-Time PCR)引物，由上海生工合成。Clip-Msp基因熒光上游引物(SyF)為ATAGGGAAGGTAGAACGG，下游引物(SyR)為CATAACATCTCCACGGAAT；GAPDH基因熒光上游引物(NyF)為GTCGTATTGGCCGTTTGGTT，下游引物(NyR)為GGGTGGAGTCGAATTTGAACA。取家蠅三齡幼蟲分為2組，一組顯微注射0.21 μL 1×1013cfu/L 0.21 μL的白假絲酵母菌，作為感染組；另一組注射等體積的PBS緩沖液，作為對照組。收集感染組和對照組不同作用時點(3、12、24及48 h)的幼蟲組織(唾液腺、血淋巴、氣管、脂肪體、腸道、馬氏管、體壁)，提取RNA并逆轉錄成cDNA，以各時間點組織的cDNA為模板，GAPDH基因為內參照，采用Real-Time PCR檢測Clip-Msp表達，儀器為ABI PRISM 7300 (ABI,USA)。按照SYBR Premix Ex TaqTM II (Perfect Real Time)說明書配制反應體系，每個樣本做3個重復，實驗進行3次。反應條件：95 ℃ 預變性30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s、40個循環，95 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s，95 ℃ 15 s。感染組Clip-MspmRNA的相對表達量用2-ΔΔCt計算，處理好的數據在Graphpad prism6上分析作圖。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 pMD19-T/Clip-Msp克隆載體的構建

家蠅三齡幼蟲總RNA電泳檢測可見：18S條帶較28S條帶明亮清晰，28S條帶暗淡模糊，說明提取的總RNA完整(圖1)。用Clip-Msp基因的克隆引物(SkF和SkR)對pMD19-T/Clip-Msp重組菌進行PCR擴增，電泳結果顯示,其PCR產物在1 524 bp左右有一特異性條帶，與預期的片段大小相一致，經測序鑒定表明Clip-Msp基因的克隆載體構建成功(圖2)。

注：M為DNA分子量標準，1為家蠅三齡幼蟲總RNA。圖1 總RNA的瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1 The integrity of total RNAs analyzed in agarose gel electrophoresis

注：M為DNA分子量標準，1為pMD19-T/Clip-Msp重組菌落PCR。圖2 pMD19-T/Clip-Msp重組菌落PCR的瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.2 Clip-Msp PCR product amplified from recombinant colony PCR of pMD19-T/Clip-Msp and analyzed in Agarose gel electrophoresis

2.2 生物信息學分析

結果顯示，Clip-Msp基因ORF長為1 524 bp，編碼507個氨基酸(圖3)。Clip-Msp蛋白的氨基酸序列中沒有信號肽(圖4)，N端第13～35位氨基酸為跨膜區，推測其為非經典分泌型蛋白(圖5)。Clip-Msp蛋白的Tryp_SPc結構域為247～494位氨基酸，Clip結構域為45～92位氨基酸，屬于單催化結構域Clip-絲氨酸蛋白酶超家族(圖6)。

圖3 Clip-Msp基因的開放閱讀框及氨基酸序列Fig.3 Clip-Msp ORF and its the amino acid sequence

2.3 Clip-Msp基因的時空表達

感染組家蠅三齡幼蟲在感染白假絲酵母菌后后不同時間點、不同組織中Clip-Msp基因的表達比較，差異有統計學意義 (P<0.05)；3 h時以血淋巴中表達量增加最高(圖7)，12 h時以脂肪體、氣管、唾液腺和腸道中表達量增加為主，脂肪體內的相對表達量最高(圖8)；24 h時以腸道中表達最高，脂肪體次之(圖9)；48 h時以血淋巴中表達量最高，馬氏管和腸道次之(圖10)。提示Clip-Msp基因主要在血淋巴、脂肪體和腸道中表達。

3 討論

注：C值為剪切位點值，在剪切位點處C值最高；S值顯示變化趨勢，在信號肽區域S值較高；Y值為綜合考慮S值和C值的一個參數，剪切點通常在S值陡峭位置的高C值位點即Y-max推測。圖4 Clip-Msp蛋白的信號肽分析Fig.4 Signal peptide analysis of Clip-Msp protein

注：Inside表示胞內區，Outside表示胞外區，Transmembrane表示跨膜區；各自數值越大，表示某氨基酸位于對應區域內的可能性越大。圖5 Clip-Msp蛋白的跨膜區分析Fig.5 Transmembrane analysis of Clip-Msp protein

圖6 Clip-Msp蛋白的功能結構域分析Fig.6 Conserved domain analysis of Clip-Msp protein

注：(1)與對照組比較，P<0.01；(2)與對照組比較，P<0.001。圖7 三齡家蠅幼蟲感染白假絲酵母菌后3 h時不同組織中Clip-Msp相對表達Fig.7 Relative mRNA expression levels of Clip-Msp in different tissues at 3 h after infection

注：(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與對照組比較，P<0.01；(3)與對照組比較，P<0.001。圖8 感染3日齡家蠅幼蟲后12 h不同組織中Clip-Msp相對表達Fig.8 Relative expression levels of Clip-Msp in different tissues ath 12 h after infection

注：(1)與對照組比較，P<0.01；(2)與對照組比較，P<0.05；(3)與對照組比較，P<0.001。圖9 三齡家蠅幼蟲感染白假絲酵母菌后24 h不同組織中Clip-Msp相對表達Fig.9 Relative expression levels of Clip-Msp in different tissues at 24 h after infection

注：(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與對照組比較，P<0.001。圖10 三齡家蠅幼蟲感染白假絲酵母菌后48 h不同組織中Clip-Msp相對表達Fig.10 Relative mRNA expression levels of Clip-Msp in different tissues at 48 h after infection

昆蟲先天免疫(Insect innate immunity)是指當外來病原體感染昆蟲時，機體通過自身的模式識別受體來識別病原相關分子模式，從而激活相關先天免疫應答，產生抗菌肽等非特異性功能效應分子清除病原體[9-12]。家蠅不僅是重要的醫學媒介昆蟲[13-14]，也是先天免疫研究的理想模型[5-6]。本課題組前期研究發現，家蠅幼蟲感染白假絲酵母菌后Clip-Msp基因表達量增高，認為該基因與家蠅抗C.albicans感染相關[8]。通過生物信息學分析可知，Clip-Msp氨基酸序列中有一個Clip結構域和Tryp_SPc(類胰蛋白酶結構)結構域，因此它屬于Clip-絲氨酸蛋白酶超家族。分泌型蛋白通常指的是在N端有信號肽，并且依賴內質網-高爾基體途徑分泌到胞外的蛋白[15]。反之，那些不通過內質網-高爾基體途徑分泌到質膜和胞外的蛋白為非經典分泌型蛋白[16]。非經典分泌途徑包括質膜孔形成、基于膜結合細胞器、繞過高爾基體[17]。據報道，黑腹果蠅84個單結構域的Clip-絲氨酸蛋白酶中，有12個缺乏典型的信號肽，為分泌型蛋白。分析黑腹果蠅Clip-絲氨酸蛋白酶發現：cSP44和cSP56以透膜區代替信號肽分泌到胞外為非經典分泌型蛋白，cSP54和cSP229既無透膜區也無信號肽為非分泌型蛋白[18-20]。Clip-Msp的開放閱讀框無信號肽，具有透膜區，可能與黑腹果蠅cSP44和cSP56相似，是否以透膜區的非經典方式分泌到胞外或其它途徑分泌至胞外有待進一步研究。

Clip-Msp在白假絲酵母菌感染家蠅三齡幼蟲后，總體上呈先升高后降低的趨勢。血淋巴Clip-Msp相對表達量在3 h和48 h較高，脂肪體Clip-Msp表達量在12 h和24 h較高，腸道Clip-Msp表達量在24 h達到最大值。可能是Clip-Msp參與真菌免疫應答不同時間點在不同組織中起作用所致。據報道，含有發卡結構的絲氨酸蛋白酶通過昆蟲體液免疫中的水解級聯反應，激活酚氧化酶系統，引發黑化反應；參與Toll通路中的信號轉導，調控抗菌肽的合成[21-22]。當機體受到真菌感染后，Clip-絲氨酸蛋白酶前體通過自身的水解級聯反應活化成為Clip-SPs，隨后激活血細胞內的酚氧化酶原，參與血淋巴的黑化[21,23-24]。因此，感染初期(感染后3 h)Clip-Msp基因在血淋巴中表達量最高。隨著作用時間的增加，感染迅速向全身蔓延，Clip-Msp參與機體內Toll免疫信號途徑的激活，抗真菌肽在脂肪體中合成[8,25-26]。因此，感染中期(感染后12-24 h)脂肪體中Clip-Msp的表達量最高。感染中后期(感染后24 h)，感染逐漸控制，但Clip-Msp在腸道中表達量最高，可能與增強腸道局部免疫調節有關[27]。感染后期(感染后48 h)，白假絲酵母菌的數量減少，黑化現象逐漸減弱，為了防止機體過度免疫造成損傷，絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制了Clip-Msp的表達[28]。但血淋巴中表達量仍然很高，可能與白假絲酵母菌感染血淋巴導致腸道菌群失調有關。在感染后檢測的7種組織中，以血淋巴、脂肪體和腸道的表達量增加最為明顯。推測Clip-Msp主要在血淋巴、脂肪體和腸道中表達。關于Clip-Msp在家蠅三齡幼蟲體內的免疫調節功能，課題組將進一步研究。

綜上所述，本研究成功構建了pMD19-T/Clip-Msp克隆載體，Clip-Msp基因開放閱讀框全長1 524 bp，共編碼507個氨基酸，無信號肽，存在跨膜區，屬于非經典分泌型蛋白；Clip-Msp蛋白的N端存在一個Clip結構域，C端有一個Tryp_SPc催化結構域，屬于單催化結構域Clip-絲氨酸蛋白酶超家族；白假絲酵母菌感染家蠅三齡幼蟲后，Clip-Msp基因在不同時間點、不同組織中表達存在差異(P<0.05)，主要分布在家蠅三齡幼蟲的血淋巴、脂肪體和腸道中。