甜瓜種子細菌性果斑病菌PCR檢測方法的研究

李菊芬，林 濤，馬國斌

(上海市農業科學院設施園藝研究所，上海市設施園藝技術重點實驗室，上海 201106)

細菌性果斑病(Bacteiral fruit blotch，簡稱BFB)是一種嚴重危害葫蘆科植物的世界性病害，其病原為西瓜嗜酸菌(Acidovorascitrulli)[1]，是一種活體營養型細菌，屬于革蘭氏染色陰性菌。近些年，隨著我國瓜類作物種植規模的不斷擴大，果斑病時有發生，曾給部分瓜類產區造成過較大損失。該病已被列為我國對內、對外的植物檢疫性病害。瓜類細菌性果斑病為典型的種傳細菌性病害[2]，建立一套快速、簡便、靈敏的檢測方法是當務之急。目前，隨著PCR技術的廣泛應用，國內外已有許多應用PCR技術檢測西瓜、甜瓜種子細菌性果斑病菌的相關報道[3-5]。在傳統PCR的基礎上，免疫富集PCR[6-7]、免疫磁性分離PCR[8-9]、實時熒光定量PCR[10-13]等方法的應用大大提高了檢測的靈敏度，但這些方法操作程序復雜、前期準備工作量大、所需儀器、試劑較為昂貴，不適合一般實驗室進行快速檢測。本研究在傳統PCR技術的基礎上，對檢測方法進行篩選優化，以期形成一套簡單實用，并能在甜瓜種子實際生產中廣泛應用的果斑病菌快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甜瓜(CucumismeloL.)種子：新疆繁育的自然攜帶瓜類細菌性果斑病菌的甜瓜種子。供試菌株：由中國農業科學院鄭州果樹研究所提供的細菌性果斑病標準菌株(Acidovorasavenaesubsp.citrulli，簡稱Ac)。

1.2 試劑與儀器

普通PCR所需試劑均購于天根生化科技(北京)有限公司。PCR儀為BIO-Rad T100TMThermal Cycler。實時熒光定量PCR采用日本TaKaRa公司的SYBR green熒光染料，儀器為Bio-Rad CFX96TMReal-Time PCR System。使用核算蛋白檢測儀(Bio-Rad)測定OD600 nm值。

1.3 引物篩選

選用3對特異引物BX-L1BX-S-R2[4]、HB2F2HB2R2[5]和SEQID4mSEQID5[3]分別進行PCR和實時熒光定量PCR檢測，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列及PCR反應條件(略有改動)詳見表1。

PCR反應體系(25 μL)：10×buffer 2.5 μL，MgCl22 mmolL，dNTPs 0.2 mmolL，Taq DNA 聚合酶 1 U，正反向引物各0.2 μmolL，模板為1 μL種子提取液，無菌三蒸水補齊。以標準Ac菌株為模板作為陽性對照，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察并拍照。

表1 檢測細菌性果斑病菌的3對特異引物及PCR擴增條件

實時熒光定量PCR反應體系按照TaKaRa SYBR?Premix Ex TaqTM說明書進行，擴增程序采用Bio-Rad CFX實時熒光定量PCR儀默認程序，即95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s， 40個循環；每個循環結束時收集熒光信號。

Acidovorasavenaesubsp.Citrulli菌株接種在液體KB培養基[14]中，28℃、220rmin振蕩培養過夜，離心收集菌體，加入1mL無菌水至懸浮狀態，根據測得的OD600 nm值，用無菌水分別配成1×107CFUmL、1×106CFUmL、1×105CFUmL、1×104CFUmL、1×103CFUmL、1×102CFUmL 6個濃度梯度的菌懸液。以不同濃度的菌懸液為模板進行實時熒光定量PCR檢測，根據Ct值繪制每對特異引物的標準曲線。試驗重復3次。

1.4 種子的不同處理方式

分別取帶菌種子100粒，進行以下3種處理。處理A：完整種子直接放入滅菌三角瓶中。處理B：種子去殼后，將種殼和種仁一起放入滅菌三角瓶中。處理C：將種子放入滅菌研缽中研磨至粉碎后，移入滅菌三角瓶中。分別向三角瓶中加入10mL滅菌雙蒸水，于28℃、220rmin搖培12h，取1 μL提取液作為PCR模板，以標準Ac菌株為模板作為陽性對照，分別進行PCR和實時熒光定量PCR檢測。各處理重復3次。

1.5 不同的提取液處理

分別取帶菌種子100粒放入滅菌三角瓶中，進行以下不同處理。處理a：加入10mL滅菌雙蒸水。處理b：加入10mL 磷酸緩沖液(PBS Buffer；137 mmolL NaCl，2.7 mmolL KCl，10 mmolL Na2HPO4∶2H2O，2mmolL KH2PO4)。處理c：加入10mL KB液體培養基。將三角瓶于28℃、220rmin搖培12h，取1 μL提取液作為PCR模板，以標準Ac菌株為模板作為陽性對照，分別進行PCR和實時熒光定量PCR檢測。各處理重復3次。

1.6 不同的提取時間處理

取帶菌種子100粒放入滅菌三角瓶中，加入10mL滅菌雙蒸水，于28℃、220rmin分別振蕩培養3 h、6 h、12 h、24h，取1 μL提取液作為PCR模板，以標準Ac菌株為模板作為陽性對照，分別進行PCR和實時熒光定量PCR檢測。各處理重復3次。

2 結果與分析

2.1 不同引物對PCR和實時熒光定量PCR檢測的影響

普通PCR擴增結果表明(圖1)，3對特異引物均能擴出各自的特異條帶，均可用于檢測甜瓜種子攜帶的果斑病菌。但經多次重復試驗綜合比較發現：引物HB2F2HB2R2的擴增產物易形成二聚體；引物SEQID4mSEQID5擴增的特異條帶亮度較弱；引物BX-L1BX-S-R2的擴增產物不易形成二聚體，且條帶較亮，效果相對較佳，因此后續試驗的普通PCR擴增均采用此引物。

以1×102—1×107CFUmL 6個濃度梯度的標準菌株菌懸液為模板，分別用3對特異引物進行實時熒光定量PCR擴增，根據Ct值繪制標準曲線。結果表明，引物SEQID4mSEQID5在進行標準菌液的實時熒光定量PCR時，檢測到的Ct值與相應菌液濃度的對數值呈較好的線性相關(R2=0.9917)(圖2)，而且PCR產物的特異性好，熔解曲線顯示產物只有特異性的一個峰(圖3)。對引物HB2F2HB2R2和引物BX-L1BX-S-R2的實時熒光定量PCR反應產物進行熔解曲線分析，未獲得特異性單峰，且Ct值與菌液濃度的對數值沒有很好的線性相關。綜上結果，引物SEQID4mSEQID5適合用于Ac的菌落實時熒光定量PCR檢測，因此后續試驗實時熒光定量PCR均采用該引物。

2.2 不同種子處理方式對PCR和實時熒光定量PCR檢測的影響

帶菌甜瓜種子經過3種不同方式處理后，其PCR檢測結果也有所不同。由圖4可以看出，以處理C為模板進行PCR擴增，沒有擴增出特異條帶(279bp)。而處理A和處理B均能擴增出目的條帶，且條帶亮度差異不明顯，處理A較B稍亮。但處理A無需研磨或去殼，操作簡便。綜上比較可知,處理A，即以完整帶菌種子直接加水搖培后得到的提取液進行PCR擴增，效果相對較佳。

實時熒光定量PCR檢測結果顯示：3種不同處理方式中，以完整種子浸提液為模板檢測到的Ac濃度最高，“種殼+種仁”處理次之，而以磨碎種子浸提液為模板，則無檢測數據。這與普通PCR的檢測結果一致。

2.3 不同提取液對PCR和實時熒光定量PCR檢測的影響

帶菌甜瓜種子用3種不同的浸提液提取后，其PCR檢測結果差異較大(圖5)。處理c PCR擴增后無特異條帶(279bp)出現。處理a和處理b均可擴增出目的條帶，但處理a的條帶較亮，檢測效果最佳。

實時熒光定量PCR結果表明：以無菌水為浸提液檢測到的Ac濃度最高，PBS為浸提液次之，以液體KB培養基為浸提液，則無檢測數據。這與普通PCR的檢測結果一致。

2.4 不同提取時間對PCR和實時熒光定量PCR檢測的影響

如圖6所示，帶菌甜瓜種子加無菌水分別搖培3 h、6 h、12h后，PCR均能擴增出明顯的特異條帶(279bp)；但搖培24h時，則無目的條帶出現。

實時熒光定量PCR結果顯示：經3h、6h和12h搖培處理后，均能檢測到較高的Ac含量，而搖培24h，則無檢測數據。這與普通PCR的檢測結果一致，表明搖培時間在3—12h為宜，至24h后，檢測結果受到極大影響。

3 討論

在傳統PCR檢測技術的基礎上，本研究對甜瓜種子細菌性果斑病菌的檢測方法進行了篩選優化。任毓忠等[15]研究表明，種皮的帶菌量遠遠高于種仁。為了獲得帶菌量較多的浸提液模板，本研究對帶菌種子進行了不同處理。結果表明，處理A(完整帶菌種子加水搖培)和處理B(帶菌種子去殼后，種殼和種仁一起加水搖培)均能通過PCR擴增出目的條帶，條帶亮度差異不明顯，其實時熒光定量PCR均能檢測到較高的Ac濃度。這說明用完整種子搖培后浸提液中的帶菌量和種殼+種仁搖培后的帶菌量接近，表明細菌性果斑病菌主要附著在種子表皮，這與任毓忠等[15]的研究結果一致。處理C(以磨碎種子浸提液為模板)的PCR擴增效果較差，可能是由于種子研碎后，大量蛋白、油脂等雜質混入浸提液，嚴重影響了PCR的擴增效率。綜合比較，可直接用完整種子進行搖培檢測。

本研究表明，帶菌甜瓜種子經搖培3—12h，其PCR檢測結果基本不受影響，均能擴增出明顯的目的條帶；但搖培至24h，卻無目的條帶出現。這可能與搖培24h后，部分甜瓜種子開始萌發，造成大量雜質混入浸提液影響PCR結果有關，其原因有待于進一步深入探討。

不同引物的PCR擴增結果顯示，引物BX-L1BX-S-R2的擴增效果最佳。而杜艷媚等[16]參照Bahar等[4]的方法，以西瓜果斑病菌菌液為模板，BX-L1BX-S-R2引物卻不能擴增出目的片段，這可能是由于國內Taq DNA 聚合酶(Sigma-Aldrich)等PCR試劑與國外不同，因此反應條件也應做相應的改變，以獲得最佳結果。本試驗對BX-L1BX-S-R2引物擴增條件中的退火溫度進行了優化調整，當退火溫度降至60℃時，即可擴增出明顯的目的條帶。而對于實時熒光定量PCR，引物SEQID4mSEQID5則是最佳選擇。因此對Ac進行檢測時，應根據實際需求選用相應的引物。

綜上，本研究優化得到的PCR檢測方法簡單快捷，不需要提取細菌的DNA，只需將完整種子用無菌水搖培3h后，以浸提液為模板，即可擴增出特異性的DNA片段。定性檢測時，應首選引物BX-L1BX-S-R2進行普通PCR即可；若需要精準的定量檢測，則可選用引物SEQID4mSEQID5進行實時熒光定量PCR分析。