上海郊區小麥赤霉病菌多菌靈抗性群體動態的研究

張 穗，陳 偉，王 東，朱洪彩， 程歡歡

(1上海市農業科學院生態環境保護研究所，上海市設施園藝技術重點實驗室，上海201106；2 山東理工大學，淄博255000,；3貴州安順學院,安順561000)

小麥赤霉病(Gibberellazeae)是世界重要的小麥病害之一，中流行年份可造成產量損失5%—15%，大流行年份達10%—40%，嚴重威脅小麥的產量和品質。在我國，小麥赤霉病分布范圍較廣泛，據估計，我國發生赤霉病的麥區面積近667萬hm2，占全國小麥總種植面積的14[1-2]。1972年以來，我國防治小麥赤霉病發生的主要手段是在小麥揚花期噴灑化學殺菌劑多菌靈及其同類藥劑[3]。但是，長期單一的化學防治，導致赤霉病菌對多菌靈的抗藥性日趨嚴重[4-5]。

王建新等[6]研究發現，江蘇、安徽、浙江、湖北、山東、河南等地小麥赤霉病菌群體中均存在抗藥性。上海地區長期采用以多菌靈為主的化學防治小麥赤霉病技術，近年來防治效果呈明顯下降趨勢[7]。 本研究通過研究小麥赤霉病菌對多菌靈的抗藥性，旨在為本地區建立科學合理的小麥赤霉病防治技術體系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株的分離培養和供試藥劑

供試菌株：2013—2015年分別從上海郊區浦東、金山、青浦、崇明、嘉定、寶山、奉賢和松江8個區采集小麥赤霉病穗標本，取病粒置于PDA平板上，25 ℃培養3—5 d，長出玫紅色菌落后進行鏡檢鑒定，單孢分離純化后備用。

高抗多菌靈的赤霉菌株H：南京農業大學周明國教授提供。

供試藥劑：98%多菌靈原粉(上海悅聯化工有限公司生產)。

1.2 含藥培養基的制作[6]

含藥培養基的制作：稱取99%的氯霉素0.3 g，溶解于3 000 ml PDA培養基中，配成含100 μgmL氯霉素的PDA，分裝至400 mL的廣口瓶中，每瓶300 ml，121 ℃滅菌30 min。根據各處理所需多菌靈母液的量，用移液槍吸取并加入經高壓滅菌后的PDA培養基中，搖晃均勻，而后倒入無菌培養皿中即制得含藥培養基。

1.3 分離菌對多菌靈抗藥性水平測定[8]

1)敏感菌株和抗藥菌株的鑒定 先將所有采集的病穗標本放入4 ℃冰箱保存7—10 d，然后進行單孢分離。單孢分離菌分別移至含5 μgmL多菌靈的PDA平板上，25 ℃培養7 d。凡在含5 μgmL多菌靈PDA平板上不能夠長出菌落的分離菌為多菌靈敏感菌；凡能夠長出菌落的分離菌為多菌靈抗性菌。

2)敏感菌株EC50的測定 在含多菌靈0(CK)、0.025 μgmL、0.05 μgmL、0.1 μgmL、0.2 μgmL、0.4 μgmL、0.8 μgmL、1.6 μgmL、2.5 μgmL的共9個濃度梯度處理的PDA平板上分別測定分離菌的菌絲生長抑制活性。每處理重復3皿，25 ℃培養3 d，待對照菌落長滿整個平板時，測量各處理的菌落直徑，并求出各分離菌對多菌靈的有效中濃度(EC50)[3，12]。

3)抗藥菌株EC50的測定 在含多菌靈0(CK)、1.25 μgmL、2.5 μgmL、5 μgmL、10 μgmL、20 μgmL、40 μgmL共7個濃度梯度的PDA平板上分別測定分離菌的菌絲生長抑制活性。每處理重復3皿，25 ℃培養3 d，待對照菌落長滿整個平板時，測量各處理的菌落直徑，并求出各分離菌對多菌靈的有效中濃度(EC50)。

根據小麥赤霉病菌對多菌靈抗藥性的劃分標準[5]：敏感菌株在含5 μgmL多菌靈的培養基上完全不能生長；中抗菌株在該培養基上正常生長，但在含50 μgmL多菌靈的培養基上完全不能生長；高抗菌株在含50gmL多菌靈的培養基上能夠生長，但是在100μgmL的培養基上完全不能生長；超高抗菌株在含100 μgmL多菌靈的培養基上仍能生長。抗性倍數=抗性菌株EC50敏菌株EC50。按抗藥性倍數(RR)的高低進行分級：敏感(RR≤5.0)、低水平抗性(5.0100.0)。

2 結果與分析

2.1 2013—2015年上海郊區小麥赤霉病菌多菌靈敏感性和抗藥性種群數量及其分布情況

經分離和鑒定，2013—2015年來自上海郊區8個區(崇明、金山、奉賢、松江、寶山、嘉定、青浦、浦東)的小麥赤霉病菌(Fusariumspp.)分離菌株共計233株，其中對多菌靈表現敏感的菌株207株，占總菌株數的88.84%；抗藥性菌株26株，占總菌株數的11.16%，且均屬于超高抗藥菌株(表1)。

表1 2013—2015年上海郊區小麥赤霉病菌對多菌靈敏感性菌株和抗藥性菌株及其分布情況

注：各區不同年份小麥赤霉病標本的數量不同，表中數據均為各區連續3年分離菌的菌株總數。**為平均占比

從分布上看，多菌靈抗藥菌群在上海郊區的分布很不均衡。除奉賢區未分離到抗藥菌株外，金山和崇明的抗性菌株出現的平均頻率較低，分別為4.55%和8.22%；其次是浦東和青浦，平均頻率分別為10.91%和12.50%；松江、寶山和嘉定抗性菌株出現的平均頻率較高，分別為20%、27.27%和28.57%(表1)。

按照對多菌靈抗藥性病菌占群體的15%—18%，赤霉病即為大流行的標準[9],2013—2015年松江、寶山和嘉定區的小麥赤霉病均達到了大流行級別。

表2 2013—2015年上海郊區部分小麥赤霉病菌對多菌靈敏感性的測定

2.2 2013—2015年上海郊區小麥赤霉病菌多菌靈抗藥種群的抗藥水平

室內毒力測定的結果表明，上海郊區小麥赤霉病菌對多菌靈敏感菌株的EC50在同一年份中各區之間差異不大，但不同年份之間明顯不同(表2)。2013、2014、2015年分離菌對多菌靈敏感菌株的平均EC50值依次為(0.463 1±0.033 7) μgmL、(0.251 6±0.038 4) μgmL、(0.130 9±0.013 8) μgmL，呈逐年下降趨勢。

上海郊區小麥赤霉病菌對多菌靈抗藥菌株的EC50在同一年份中各區之間差異不大，但不同年份之間明顯不同(表3)。2013年和2014年抗性菌株的EC50平均值分別為(11.162 3±1.413 7) μgmL和(12.303 4±0.626 3) μgmL，兩者之間差異不大，但2015年抗性菌株的EC50平均值達到(20.530 1±1.823 0) μgmL，較前兩年抗性水平明顯升高。2013—2015年，3年敏感菌株的EC50平均值為(0.276 3±0.018 5) μgmL，平均發生頻率為90.29%；抗性菌株的EC50平均值為(17.681 5±1.477 3) μgmL；超高抗性菌株出現的頻率依次為5.13%、11.61%和15.38%，呈逐年上升趨勢(表3、表4)。2013、2014、2015年上海郊區小麥赤霉病菌對多菌靈的抗藥水平逐年上升，其抗性倍數分別為23.00、46.14和 156.84。2015年由前兩年的中等水平抗性急劇上升為高水平抗性(表4)。

表3 2013—2015年上海郊區部分小麥赤霉病菌對多菌靈抗藥性的測定

表4 2013—2015年海郊區小麥赤霉病菌多菌靈抗藥種群的抗性水平

2.3 不同小麥赤霉病菌分離菌株對多菌靈抗性的遺傳穩定性

對2013來年自同一病穗的4株禾谷鐮孢分離菌進行室內毒力測定的結果表明，這些分離菌對多菌靈的EC50值與赤霉菌株H的EC50值均比較接近，在(8.586 2±2.564 6)—(14.849 1±1.665 7) μgmL，抗性比值在0.88—1.51。表明上海郊區分離的小麥赤霉病菌抗藥菌株的抗性較高且具有群體遺傳的穩定性(表5)。

表5 2013年上海郊區同一病穗不同小麥赤霉病分離菌株對多菌靈的抗性測定

3 討論與結論

據報道，1999—2001年上海郊區小麥赤霉病菌多菌靈抗性菌群出現的頻率較低，為3.00%—6.03%[10]。當抗藥菌株達到10%時，多菌靈的防治效果將下降至60%[2]。本研究結果表明， 2014和2015年該地區赤霉病菌多菌靈抗性菌株出現的頻率明顯增高，分別達到了11.61%和15.38%(表4)，這與近年來上海郊區小麥赤霉病發生嚴重、麥田多菌靈防治效果急劇下降的情況相吻合[2,7，12]，表明病菌多菌靈抗性菌群數量的增加和抗性水平的升高是該地區小麥赤霉病發生日趨嚴重的原因之一。

在上海各區之間多菌靈抗藥菌群的分布很不均衡。青浦、松江、寶山和嘉定區的大部分邊界與小麥赤霉病菌的多菌靈抗性水平高的江蘇毗鄰[11]，其抗藥菌群均在10%以上,這些抗藥菌群是否來自江蘇需進一步研究(表1)。

自2013年起，上海郊區在麥田停止使用多菌靈，并大面積推廣秸稈還田耕作制度。本研究中，2013年、2014年、2015年上海郊區小麥赤霉病菌對多菌靈敏感的種群平均占比達到了90.29%，EC50值呈逐年下降趨勢。沒有了藥劑選擇壓力，分離菌的敏感性增強，這與2013年起麥田停止使用多菌靈存在明顯的關聯。多菌靈是防治小麥赤霉病的特效藥，耐雨水沖刷，且價格低廉[1]，該藥劑今后能否繼續在上海郊區使用還需進一步監測赤霉病菌多菌靈抗藥性菌群的占比、分布及其抗性水平等的變化情況。

盡管上海郊區小麥赤霉病菌多菌靈抗藥種群的平均占比只有11.16%，但其EC50值呈逐年上升趨勢(表1，表3，表4)，且與2013年起大面積推廣秸稈還田呈明顯的正相關性。耕作制度的改變會導致農田生態系統發生一系列的變化。秸稈全量還田，若田間處理不徹底會使田間的秸稈量增大，從而給赤霉病菌提供了充足的存活條件，也為小麥赤霉病的發生提供了必要的基礎條件。這些現象均應引起農業生產部門的高度重視，加強赤霉病敏感菌群和抗性菌群動態變化的監測與研究，制定科學合理防控技術體系，切實控制這一病害的發生與為害。

致謝：上海市農業技術推廣服務中心，浦東新區、金山、青浦、寶山、嘉定、松江、崇明、青浦、奉賢農業技術推廣中心植保部門為本研究提供了小麥赤霉病樣本材料，在此一并感謝！