利用SSR和ISSR分子標記分析崇明白扁豆種質資源的遺傳多樣性

沈 千，陳 岳，顧立君，潘俊松*

(1上海交通大學農業與生物學院，上海 200240，2 崇明區農業技術推廣中心，上海202150，3上海市崇明區蔬菜科學技術推廣站，上海202150)

崇明白扁豆，學名利馬豆(PhaseoluslunatusL.)，起源于墨西哥南部和中美洲,引入我國時間不詳[1]。崇明白扁豆是崇明地區重要的特色蔬菜品種之一，細嫩酥糯、清香味美、營養豐富，于2008年獲得國家地理標志注冊商標,具有十分良好的發展前景。但現階段對崇明白扁豆研究較少，且主要集中在栽培和生理生化方面[2-4]，缺少有關崇明白扁豆的分類及親緣關系的鑒定研究。此外，傳統的通過株型、花色等形態學標記進行分類的方法，雖然能夠在田間直接觀察和統計，但形態學標記受到環境的限制，部分性狀不能表達，以致不能發現確實存在的某些性狀，使觀測中的一些重要性狀被隱藏或忽略。另外，田間性狀調查所需的周期長，數據不穩定。而利用分子標記技術可以彌補形態學研究的短板，進一步體現種質的遺傳多樣性狀況。

本試驗所用材料為崇明白扁豆、云南大白蕓豆和白扁豆。很多消費者誤以為崇明白扁豆即為白扁豆，其實崇明白扁豆是俗稱。崇明白扁豆，即利馬豆，屬于豆科(Leguminosae)菜豆屬(Phaseolus)。云南大白蕓豆(PhaseoluslunatusL.)在一些地方也被稱為白扁豆，與崇明白扁豆是同屬(菜豆屬)同一個種，而白扁豆(LablabpurpureusL.)屬于豆科(Leguminosae)扁豆屬(Lablab)。本研究利用大豆SSR(Simple sequence repeat，簡單重復序列)和ISSR(Inter-simple sequence repeat，簡單重復序列中間區域)分子標記對64份種質材料進行遺傳多樣性分析，希望能揭示崇明不同地區崇明白扁豆之間的親緣關系，并區分因俗稱而被混淆的豆類名稱，為今后崇明白扁豆的種質資源分類、鑒定以及品種保護提供理論依據和實踐參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

參試的59份崇明白扁豆樣本均由崇明區港西鎮北雙村暉遠蔬菜園藝場提供；采購1份江蘇海門的利馬豆、1份云南麗江的大白蕓豆和3份分別來自山東青島、廣西巴馬、河南洛陽的白扁豆作對照(表1)；所有材料均為蔓生型。因為崇明白扁豆研究很少，相關SSR分子標記沒有開發，所以采用同科的大豆SSR分子標記進行研究。

注：1—59號材料來源于上海崇明不同鎮。數值均為平均值±標準差

1.2 試劑

試驗所用的2×HieffTMPCR Master Mix購于上海翊圣生物科技有限公司；過硫酸銨、NaOH、硝酸銀、98%去離子甲酰胺、二甲苯青、溴酚藍、丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺購于上海生工生物工程股份有限公司；無水乙醇、甲醛等購于國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂糖購于北京沃比森科技有限公司。所用DNA引物由上海華津生物科技有限公司合成。

1.3 崇明白扁豆基因組DNA的提取

采用CTAB法[5]提取崇明白扁豆三出復葉時期的嫩葉片基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA溶液的質量，DNA純度和濃度利用NanoDrop 2000紫外可見光譜儀(Thermo)進行測定。DNA溶液貯藏于-20℃備用。

1.4 SSR-PCR

PCR反應體系如下：5 μL 2×HieffTMPCR Master Mix，DNA模板1 μL(50 ngμL)；上下游引物(10 μmolL)各0.5 μL；添加ddH2O至10 μL。PCR擴增反應程序：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環；72℃延伸5 min。

1.5 ISSR-PCR

采用加拿大哥倫比亞大學(UBC)公布的100條ISSR引物，選取6個供試材料(樣品3、11、25、36、48、63)，對引物進行多態性篩選。

PCR反應體系如下：5 μL 2×HieffTMPCR Master Mix，DNA模板1 μL(50 ngμL)；引物(10μmolL) 0.5 μL；添加ddH2O至10 μL體系。PCR擴增反應程序：預變性94℃ 3 min；變性94℃ 30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸5 min。

1.6 數據分析

PCR產物首先用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測有無產物，有產物的再用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，硝酸銀銀染顯色。白熾燈下觀察電泳結果，進行數據統計和掃描照相。

擴增產物有帶型記為“1”，無帶型記為“0”，缺失數據記為“-”。采用NTSYSpc V2.11軟件進行數據分析，以Jaccard計算遺傳相似系數，利用非加權組平均法(UPGMA)對64份白扁豆種質資源進行聚類分析，構建系統進化樹。多態性信息(PIC)值計算方法參照Botstein等[6]。

表2 大豆SSR分子標記的引物信息及其多態性

2 結果與分析

2.1 崇明白扁豆材料間多態性SSR和ISSR引物篩選

從48對大豆SSR引物中，篩選出11對帶型清晰、多態性較好的引物，多態性比率為22.9%；從100條ISSR引物中篩選出19條擴增穩定、多態性好的引物，多態性比率為19.0%(表2和表3)，用篩選到的多態性引物分別對64份白扁豆材料進行PCR擴增。11對SSR引物共擴增出84條多態性條帶，每個位點的等位基因數為3—12個，平均為7.6個(表2)；19條ISSR引物共擴增出151條多態性條帶，每條引物擴增條帶為5—13條，平均為7.9條(表3)。多態信息量(PIC)可以評估引物多態性信息量水平。本試驗所篩選的11對SSR引物中，PIC值的范圍為0.71(Satt385)到0.94(Satt520)；19條ISSR引物中，PIC值的范圍為0.82(UBC827)到0.94(UBC834)，表明所篩選的引物具有較高的多態性，可以有效地用于白扁豆遺傳多樣性分析。圖1和圖2為SSR和ISSR分子標記的引物分別對2份崇明白扁豆進行PCR擴增后得到的電泳圖譜。

表3 ISSR分子標記的引物信息及其多態性

2.2 崇明白扁豆材料聚類分析

2.2.1 利用SSR和ISSR分子標記聚類分析構建的樹狀圖

采用NTSYSpc V2.11軟件，分別利用大豆SSR和ISSR分子標記數據構建相應的樹狀圖(圖3和圖4)。大豆SSR分子標記遺傳相似系數介于0.39—0.99，其中材料5和19、38和46、60和62的相似系數最大，為0.9855。在相異系數0.74處，可將64份種質材料分成4類，材料64獨自為第I類；材料60、62和63為第II類；材料27和61為第III類；剩下的材料均來自崇明，為第IV類，包括材料1—26和28—59(圖3)。ISSR分子標記遺傳相似系數介于0.33—1.00，其中材料51和54，44、45和46相似系數最大，為0.9968。ISSR分子標記在相異系數0.86處，也可將64份種質材料分成4類，材料64獨自為第I類；材料60、62和63為第II類；材料59和61為第III類；剩下的材料均來自崇明，為第IV類，包括材料1—58(圖4)。比較圖3和圖4，SSR和ISSR兩種分子標記獲得了相似但不完全相同的聚類樹，說明兩種分子標記之間存在一定的差異,但都能較好地分析崇明白扁豆的遺傳差異。圖3中材料27與61為一類；而圖4中材料59與61為一類，表明不同分子標記技術所能檢測到的多態性比率不同。

2.2.2 綜合SSR和ISSR分子標記構建的樹狀圖

將兩種分子標記分析的數據一起用NTSYSpc V2.11軟件進行聚類分析，得出64份供試材料的聚類樹狀圖(圖5)，遺傳相似系數范圍為0.37—1.00。在相似系數0.82處，可將材料分為4個類群。材料64獨自成為第I類；材料60、62和63為第II類；材料27和61為第III類；剩下的材料均來自崇明，為第IV類，包括材料1—26和28—59。其中，相似系數最大的是材料45和46，為0.9957，表明其遺傳相似度較高，親緣關系較近；相似系數最小的是材料44和63，為0.2808，表明其遺傳相似度較低，親緣關系較遠。

由兩種分子標記綜合聚類(圖5)與SSR分子標記聚類(圖3)、ISSR分子標記聚類(圖4)比較可知，兩種分子標記綜合聚類與SSR分子標記聚類和ISSR分子標記聚類基本一致。兩種分子標記綜合聚類和SSR分子標記聚類大體一致，而ISSR分子標記和前面兩者差異性體現在第III類。ISSR分子標記聚類圖中第III類是材料59與61，而綜合聚類圖和SSR分子標記聚類圖中第III類是材料27與61，其主要原因可能是兩種分子標記所檢測的基因座位不同，SSR分子標記檢測的是重復序列，而ISSR分子標記檢測的是重復序列中間區域。

2.3 崇明白扁豆性狀與SSR和ISSR分子標記的相關性分析

綜合參試材料的性狀(表1)和聚類結果(圖5)，崇明白扁豆大多數聚類在一起，單一性狀基本呈聚集式分布。在花色上，類群IV和類群III呈淡黃色；類群I呈淡紫色；類群II為紫色。在種莢顏色上，除類群IV的材料26和53呈淡綠色外，其他材料均呈綠色。在豆色上，類群I呈乳白色；類群II呈黃白色；類群III呈淡綠色；類群IV除了材料26和53呈紫色，其余呈淡綠色。在鮮百粒重方面，材料1—63基本接近一致。綜上所述，類群III和類群IV親緣關系最近。

3 討論

3.1 ISSR和大豆SSR分子標記在植物中的應用

目前,在開放的基因組信息中，關于利馬豆的基因組信息相對較少,針對利馬豆開發SSR分子標記的成本費用相對較高。但是已有研究發現，豆科植物中的SSR分子標記具有通用性[7-8]。相比于利馬豆，大豆植物的基因組已經開發出了相當多的SSR分子標記。姚陸銘等[9]對源自中國、美國、泰國及印度的31份扁豆資源樣本進行SSR分子標記分析，發現大豆的SSR分子標記能很好地適用于扁豆的遺傳多樣性分析；扁豆資源主要可以分為3組且相互間無地域特異性差異，這表明扁豆資源中遺傳多樣性相對較低。相比于SSR分子標記，ISSR分子標記的標記效率較高，在指紋圖譜構建時可用較少的引物區分不同的品種，但在試驗的重復性方面差于SSR分子標記[10-12]。肖志娟[13]對不同核桃品種遺傳多樣性的研究表明，在多態位點數的有效性方面，ISSR分子標記略高于SSR分子標記；在遺傳差異性方面，SSR分子標記略高于ISSR分子標記。SSR分子標記的多態性程度高，且呈共顯性遺傳，符合孟德爾遺傳規律。李永祥等[14]通過SSR和ISSR分子標記對12份披堿草屬植物進行遺傳多樣性比較分析，發現兩種分子標記效率和相關性在不同親緣關系水平上有所不同,說明不同的標記具有不同的多態性檢測范圍。綜合上述考慮，本研究利用大豆的SSR分子標記和ISSR分子標記對利馬豆的遺傳多樣性進行分析。從本研究結果可以看出，大豆的SSR分子標記比ISSR分子標記更能有效地區分崇明白扁豆的親緣關系。

3.2 崇明白扁豆種質資源分析

本研究顯示，64份種質材料的SSR分子標記多態性比率為22.9%，ISSR分子標記多態性比率為19.0%。所收集的利馬豆材料間的遺傳相似系數變幅較小，在0.84—1.00，表明其差異性不明顯，相似性較大。綜合分析表明，崇明白扁豆親緣關系十分相近，遺傳背景狹窄，區別較小，同一來源地的材料趨于聚為一類。這可能是由于崇明白扁豆長期改良、優質栽培并應用推廣，導致所收集的種質材料趨于接近，從而使崇明白扁豆親緣關系接近。來自江蘇海門的材料61利馬豆與崇明白扁豆的親緣關系最接近，江蘇海門與上海崇明島僅一江之隔，可以看出，相鄰的材料來源地存在親緣關系接近的現象。來自廣西的白扁豆(60)、河南的白扁豆(62)、山東的白扁豆(63)聚為一類；來自云南的大白蕓豆(64)單獨聚為一類，分子標記分析很容易區分白扁豆、大白蕓豆與崇明和江蘇海門利馬豆之間的關系，準確揭示崇明白扁豆(利馬豆)、白扁豆、大白蕓豆的親緣關系。