饒河地區(qū)野生動物攜帶病毒的基因分型及序列特征分析

王奧男，黨蘊琦，李博琦，李永久，劉 鑄

黑龍江省饒河縣地處中俄邊境，是中俄貿(mào)易重要口岸，該地區(qū)包含濕地沼澤和山地森林，物種多樣性豐富。隨著新發(fā)和復(fù)發(fā)傳染病給全球帶來越來越重的疾病負(fù)擔(dān)，人們開始注重決定疾病風(fēng)險和相關(guān)生態(tài)學(xué)過程的環(huán)境因素的問題[1-2]。很多傳染病的暴發(fā)和人類的貿(mào)易、鳥類的遷徙等息息相關(guān)。蟲媒傳染病依靠吸血節(jié)肢動物進(jìn)行傳播，是許多自然疫源性疾病的病原體。對環(huán)境變化極為敏感，其錯綜復(fù)雜的生態(tài)過程影響病媒在環(huán)境中的分布和數(shù)量，以及其與人類和非人類貯主宿主間的接觸[3-5]。很多自然疫源性疾病的病原體(包括蟲媒病毒)儲存于小型哺乳動物，特別是嚙齒動物體內(nèi)，因此嚙齒動物對自然疫源性疾病的傳播具有重要作用[6]。另外，鳥類是自然界中病原體的重要貯存宿主。

黃病毒屬病毒(Flavivirus)和甲病毒屬病毒(Arenavirusgenus)屬于蟲媒病毒，其中大多數(shù)可自然感染多種脊椎動物，主要是鳥類、鼠類。饒河地區(qū)是候鳥遷徙的重要遷徙地和棲息地，鼠類資源豐富。黑龍江省是最嚴(yán)重、最典型的蜱傳腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus)分布流行區(qū)之一[7]。漢坦病毒(Hantavirus, HV)屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)漢坦病毒屬(Hantavirus)，自然宿主為嚙齒類動物。HV對嚙齒類只造成一過性感染，對宿主的壽命和繁衍并無影響，但其可通過宿主的排泄物感染人類并引發(fā)兩種嚴(yán)重的臨床疾病：腎綜合征出血熱(hemorrhgic fever with renal syndrome, HFRS)和漢坦病毒肺綜合癥(hantavirus cardiopulmonary syndrome, HPS)。我國存在漢城型(Seoul virus,SEOV)和漢灘型(Hantaan virus,HTNV)兩種 HV 型別，中國擁有世界上最高的HFRS發(fā)病率，而黑龍江是最嚴(yán)重的疫區(qū)之一[8]。

本研究對饒河地區(qū)部分野生動物進(jìn)行黃病毒屬病毒、甲病毒屬病毒和漢坦病毒等病原體篩查，對檢測出的陽性樣本的基因片段進(jìn)行分型和核苷酸序列分析，確定當(dāng)前饒河地區(qū)宿主動物所攜帶病原體的基因型別，分析其變異情況，對該地區(qū)自然宿主動物的感染情況進(jìn)行監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1樣本的采集與處理 本次樣本由饒河檢疫局口岸科提供(2018年秋季野外捕捉)，將樣本分類鑒定(表1)，鑒定完畢后無菌解剖，取完整臟器(腦、肺、肝、脾、腎、膀胱、心、腸、胃)分別放入凍存管內(nèi)，置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。

表1 待測樣本的物種和數(shù)量
Tab.1 Species and number of samples to be tested

物 種數(shù)量東方田鼠(Microtus fortis)9褐家鼠(Rattus norvegicus)5黑線姬鼠(Apodemus agrarius)5黃鼬(Mustela sibirica)1黑龍江刺猬(Erinaceus amurensis)1綠頭鴨(Anas platyrhynchos)2白骨頂雞(Fulica atra)1松鼠(Sciurus vulgaris)52總 計76

1.2RNA的提取 將每只動物的每個臟器分別采用TRIZOL(Takara)法提取RNA。RNA溶解于30 μL RNase-free water。

1.3引物設(shè)計與合成 本次研究所需引物(表2)由北京華大基因合成。

表2 引物詳細(xì)信息
Tab.2 Primer detailed information

引物序列(5′-3′)位置/bp黃病毒屬病毒通用引物[9](Flavivirus)HF: AATGTATGCAGATGATACAGCAGGNTGGGAYACHR: TCTATCATCAATTGGTTTAACAACACARTCRTCNCC421-445 甲病毒屬病毒通用引物[10](Arenavirusge-nus)JF: GGAGTTAGAACGGCGTATTGGATAGGNTTYGAYACJR: CATCTGTAGCCAGGATGCCTGTCATYTGRTCRC510-550 巢式PCR第一輪漢坦病毒通用引物[11](HV)HVF: AAAAGTAGGTGITAYATCYTIACAATGTGGHVR: GTACAICCTGTRCCIACCCC445 巢式PCR第二輪漢坦病毒漢城型引物[11](SEOV)SEOVF: GTGGACTCTTCTTCTCATTATTSEOVR: TGGGCAATCTGGGGGGTTGCATG418 巢式PCR第二輪漢坦病毒漢灘型引物[11](HTNV)HTNVF: GAATCGATACTGTGGGCTGCAAGTGCHTNVR: GGATTAGAACCCCAGCTCGTCTC383

1.4RT-PCR擴(kuò)增(TAKARA RR057A試劑盒) 將RNA產(chǎn)物各取10 μL，結(jié)合表1，按物種和器官類型進(jìn)行混合，如東方田鼠腦(90 μL)、東方田鼠肝(90 μL)、褐家鼠肺(50 μL)。反應(yīng)條件如下：Prime Script 1 step Enzyme Mix 1 μL，2×1 step Buffer(Dye Plus)12.5 μL，RNase Free dH2O 8.5 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，RNA混合模板 1 μL，合計25 μL；50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min(返回第3步，35個循環(huán))，4 ℃ ∞。

1.5PCR產(chǎn)物鑒定及核苷酸序列測定 取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。若條帶的相對分子質(zhì)量與預(yù)期片段大小相同，則表明為特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物由北京市華大基因公司進(jìn)行核苷酸序列測序。

1.6核苷酸序列分析 應(yīng)用DNAStar軟件包對核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹和氨基酸序列的比對，其中引用序列均來自GenBank。

2 結(jié) 果

2.1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定及測序鑒定 經(jīng)電泳鑒定，所有樣本中均無黃病毒屬和甲病毒屬的目的片段。S11 (褐家鼠肺)、S13 (褐家鼠肺)、S14 (褐家鼠肺)、SS7 (松鼠肺)合計4個樣本中疑似攜帶HV目的片段(圖1)。將疑似陽性樣本PCR產(chǎn)物交送北京華大基因進(jìn)行核苷酸序列測序，結(jié)果顯示S11，S13，S14，SS7攜帶SEOV。

2.2SEOV分離株的M基因部分片段遺傳多樣性分析 以本次饒河地區(qū)分離出的4株SEOV及來自GenBank的19株國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)毒株進(jìn)行核苷酸序列比對和同源性比較(表3)。結(jié)果顯示，本次饒河地區(qū)3只褐家鼠S11、S13、S14和1只松鼠SS7中分離出的SEOV之間遺傳距離范圍為0.00～0.01，相互之間同源性很高。與黑龍江地區(qū)其他SEOV病毒株之間的遺傳距離也相對很近。

注：1-4模板均為肺部PCR產(chǎn)物，1-3為褐家鼠，4為松鼠，5為陰性對照，6為2 000 bp Marker圖1 漢坦病毒初篩套式PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 SEOV PCR product electrophoresis results

2.3SEOV分離株與HV原型毒株的系統(tǒng)進(jìn)化分析 以本次饒河地區(qū)分離出的4株SEOV的M基因部分片段與國內(nèi)外有代表性的19株SEOV的M基因部分片段共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(圖2)。通過系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)S11、S13、S14攜帶的SEO型HV親緣關(guān)系最近，SS7稍遠(yuǎn)，但總體親緣關(guān)系十分相近。與此前黑龍江省哈爾濱、佳木斯、饒河、同江，以及河北、浙江的SEOV病毒株序列親緣關(guān)系相對較近。與日本、江西、河南的SEOV病毒株序列親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

圖2 多種病毒M片段核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of nucleotide sequences of various viral M fragmentsresults

表3 多種病毒M片段核苷酸序列同源性比較
Tab.3 Comparison of nucleotide sequence homology of various viral M fragments

12345678910111213141516171819202122231-SS7_raohe_SEOV0.010.010.010.010.010.030.090.040.030.040.040.100.090.030.031.040.910.550.220.100.100.092-S14_raohe_SEOV0.010.000.000.000.000.020.080.030.020.030.030.080.080.020.021.040.880.510.240.080.080.083-S13_raohe_SEOV0.010.000.000.000.000.020.080.030.020.030.030.080.080.020.021.040.880.510.240.080.080.084-S11_raohe_SEOV0.010.000.000.000.000.020.080.030.020.030.030.080.080.020.021.040.880.510.240.080.080.085-SRHA1_raohe_KT885186_SEOV0.010.000.000.000.000.020.080.030.020.030.030.080.080.020.021.040.880.510.240.080.080.086-SRH27_raohe_KT885185_SEOV0.010.000.000.000.000.020.080.030.020.030.030.080.080.020.021.040.880.510.240.080.080.087-SRH19_raohe_KT885184_SEOV0.030.020.020.020.020.020.060.010.000.010.010.060.060.000.000.960.970.470.200.060.060.068-SRH17_raohe_KT885183_SEOV0.090.080.080.080.080.080.060.040.060.040.040.070.000.060.061.010.990.510.180.100.100.079-TJF11_tongjiang_KT885187_SEOV0.040.030.030.030.030.030.010.040.010.020.020.050.040.010.010.960.970.470.200.070.070.0710-SJMS21_jiamusi_KT885180_SEOV0.030.020.020.020.020.020.000.060.010.010.010.060.060.000.000.960.970.470.200.060.060.0611-Hebei4_hebei_AB027089_SEOV0.040.030.030.030.030.030.010.040.020.010.000.050.040.010.010.990.990.490.190.050.050.0412-Z37_zhejiang_AF190119_SEOV0.040.030.030.030.030.030.010.040.020.010.000.050.040.010.010.990.990.490.190.050.050.0413-Hubei1_hubei_S72343_SEOV0.100.080.080.080.080.080.060.070.050.060.050.050.070.060.060.890.950.510.200.100.100.1014-SDN8_dongning_KT885170_SEOV0.090.080.080.080.080.080.060.000.040.060.040.040.070.060.061.010.990.510.180.100.100.0715-SJC12_Harbin_KT885175_SEOV0.030.020.020.020.020.020.000.060.010.000.010.010.060.060.000.960.970.470.200.060.060.0616-SJC20_Harbin_KT885176_SEOV0.030.020.020.020.020.020.000.060.010.000.010.010.060.060.000.960.970.470.200.060.060.0617-MF-43_Russia_AJ011648_KBRV1.041.041.041.041.041.040.961.010.960.960.990.990.891.010.960.960.851.181.211.161.161.1218-P360_Russia_L08755_PUUV0.910.880.880.880.880.880.970.990.970.970.990.990.950.990.970.970.851.591.201.091.090.9919-76-118_N.Korea_Y00386_HTNV0.530.510.510.510.510.510.470.510.470.470.490.490.510.510.470.471.181.590.400.530.530.4620-Gou3_zhejiang_AF145977_SEOV0.220.240.240.240.240.240.200.180.200.200.190.190.200.180.200.201.211.200.400.190.190.2621-L99_jiangxi_AF288298_SEOV0.100.080.080.080.080.080.060.100.070.060.050.050.100.100.060.061.161.090.530.190.000.0722-R22_henan_AF035834_SEOV0.100.080.080.080.080.080.060.100.070.060.050.050.100.100.060.061.161.090.530.190.000.0723-SR11_Japan_M34882_SEOV0.090.080.080.080.080.080.060.070.070.060.040.040.100.070.060.061.120.990.460.260.070.07

3 討 論

HV為分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，病毒的基因組分大(L)、中(M)、小(S)3個片段，3個基因片段的核酸變異以M基因片段的變異最顯著，M片段編碼病毒糖蛋白G1和G2的前體蛋白，M基因片段的變異會導(dǎo)致HV在細(xì)胞融合、結(jié)合病毒受體、血凝活性、包膜糖蛋白的表達(dá)以及糖基化等方面發(fā)生改變，從而影響HV的致病性[12]。20世紀(jì)80年代初期，我國首次分離出HV，此后通過病原學(xué)證實我國存在SEOV和HTNV兩種HV型別[13]。褐家鼠為SEOV原始宿主，黑線姬鼠為HTNV原始宿主[14-15]。黑龍江地區(qū)是SEOV和HTNV的混合型疫區(qū)[16]，是我國最早發(fā)生HFRS的地區(qū)，發(fā)現(xiàn)初期屬于以姬鼠型為主的混合型疫區(qū)，卻已有向混合型演變的趨勢[17]。本次研究發(fā)現(xiàn)饒河地區(qū)鼠類攜帶的HV以SEOV為主；親緣關(guān)系與黑龍江省其它地區(qū)常見的SEOV較近；除褐家鼠外，松鼠也攜帶SEOV。因本次實驗樣本量數(shù)量有限，雖未檢測出HTNV、黃病毒屬病毒和甲病毒屬病毒，但不能排除該型病毒在本地區(qū)宿主動物間的存在。許多疫區(qū)都存在著各自的優(yōu)勢HV基因型或亞型，這可能是因HV與本疫區(qū)的優(yōu)勢自然宿主共進(jìn)化造成的[18]。

分子流行病學(xué)表明，目前所有SEOV毒株在基于M基因部分片段的系統(tǒng)發(fā)生樹上可分為6個分支[19-20]。進(jìn)化分支1、3和4中包含的毒株主要集中在中國東北[21-22]。本次饒河地區(qū)只分離到了屬于進(jìn)化分支3的HV毒株[21,23-24]。從基因系統(tǒng)發(fā)生樹上來看，SS7毒株與SEOV序列十分相似，并且從系統(tǒng)發(fā)生樹上可推斷出SS7毒株屬于SEOV的遠(yuǎn)東地區(qū)病毒進(jìn)化分支。

黑龍江地區(qū)的氣候和自然地理條件非常適合攜帶HV宿主動物的生存和繁殖，但是隨著人們生活條件的改善，禁止伐木狩獵，家鼠和野鼠與人類交集的逐漸減少，HFRS在黑龍江省暴發(fā)的概率也越來越小。但褐家鼠有著強(qiáng)大的生存適應(yīng)力，在全球范圍都十分活躍，與人類活動關(guān)系密切，并且喜歡棲居于建筑物內(nèi)。饒河作為中俄貿(mào)易重要口岸，更要做好疫源監(jiān)測和預(yù)防宣傳工作，防止傳染病隨著進(jìn)出口貿(mào)易而廣泛傳播。

利益沖突：無